母源甲硒氨酸降低种蛋孵化后期死胚率的机理研究

Antioxidation is the most important function of selenium. Results of our previous research had showed that the antioxidant status in chick embryogenesis was significantly improved by selenomethionine(SM) in comparison with sodium selenite supplemented in the feed of broiler breeders. Oxidative damage model of chicken embryo and its hepatocyte induced by diquat and hydrogen peroxide will be established to study oxidative stress damage of chick embryo and protective effects of SM, as well as gene expression of antioxidative selenoproteins, Keap1-Nrf2 signal pathway regulation molecules and downstream cell protective factors in hepatocyte with the methods of immunohistochemistry, RT-PCR, Western-blotting, electrophoretic mobility shift assay combining with siRNA interference technology. Experiments are also conducted to analyze Nrf2 nuclear transocation and its combination with antioxidant response element, hepatocyte apoptosis and DNA damage, mitochondrial dysfunction and its membrane potential. This study will elucidate the molecular regulatory mechanism of SM involving the antioxidant function, consequently to provide a theoretical basis for SM applications in broiler breeder feed to decrease mortality of chick embryogenesis.

硒最为重要的是它的抗氧化功能，在种母鸡日粮中添加甲硒氨酸同比亚硒酸钠具有更好的抗氧化效果而提高种蛋孵化率，但其作用机理尚待进一步研究。本项目拟通过建立鸡胚及肝细胞氧化应激模型，运用免疫组织化学、实时荧光定量PCR、Western-blotting、EMSA等实验方法，结合siRNA干扰Nrf2表达技术，研究母源甲硒氨酸对发育鸡胚氧化应激损伤的保护作用、主要抗氧化硒蛋白和Keap1-Nrf2信号通路分子及其调控的下游细胞保护因子的基因表达的影响、Nrf2核转位及其与ARE结合情况、肝细胞凋亡及DNA损伤程度、线粒体形态及膜电位变化情况，旨在阐明甲硒氨酸抗氧化效果优于亚硒酸钠的分子调控机制，为种母鸡饲用甲硒氨酸降低孵化后期鸡胚死亡率提供理论依据。

项目成功建立了由敌草快诱导的鸡胚氧化应激损伤模型和由H2O2诱导的鸡肝LMH细胞氧化应激损伤模型。在此基础上，运用免疫组织化学、实时荧光定量PCR、Western-blotting、EMSA等实验方法，结合体外LMH细胞培养和siRNA干扰Nrf2表达技术，比较研究了甲硒氨酸、亚硒酸钠2种硒源处理对种蛋孵化后期鸡胚和LMH细胞氧化应激损伤的保护作用，两者差异化调控肝细胞抗氧化硒蛋白基因表达的关键环节和氧化应激相关Keap1-Nrf2-ARE信号转导通路的作用靶点。研究结果揭示：1）母种鸡饲用甲硒氨酸能通过增强鸡胚抗氧化酶（GPx，TrxR，CAT，γ-GCS）、氧化酶（MPO，XOD，MAO）和二相解毒酶（HO-1、NQO1）活性，综合提高鸡胚和LMH细胞的总抗氧化和解毒能力，降低自由基水平（ROS，NO）及其对细胞器和蛋白质、脂类等生物大分子的氧化损伤（蛋白质羰基，MDA），升高细胞线粒体膜电位（MMP），增高抗凋亡蛋白（Bcl-2）而减低凋亡蛋白（Caspase-3）水平，进而达到减低肝细胞凋亡和鸡胚死亡的保护作用。2）甲硒氨酸通过Keap1-Nrf2-ARE信号转导途径，上调Nrf2基因表达及其蛋白磷酸化水平，下调肝细胞20S蛋白酶体活性，进而激活下游基因抗氧化酶和二相解毒酶的基因表达，缓解敌草快诱导鸡胚和H2O2诱导LMH细胞的氧化应激反应，达到减少肝细胞凋亡和鸡胚发育死亡的调控作用；3）甲硒氨酸在转录和翻译水平上调控了LMH细胞主要硒蛋白（GPx、TrxR、SelP）的基因表达，显著上调了mRNA及其蛋白的半衰期，而达到增强其表达活性的调控作用。上述甲硒氨酸处理的总体实验结果皆明显优于亚硒酸钠。该研究结论为母源甲硒氨酸营养调控鸡胚发育而提高种蛋孵化率提供了科学依据，对发育营养学研究和家禽高效繁育生产具有重要理论意义和实际应用价值。