全局转录工程选育抗铅表型酿酒酵母及其重金属抗逆分子机制研究

Bioremediation of heavy metal contamination from chemical industry has become the focus in the field of biochemical engineering research. Owing to its good features, yeast is thought to be one of the ideal type of microorganisms for bioremediation of heavy metal contamination, but it still suffers from low tolerance of heavy metal. This project aims to screen higher heavy metal tolerance Saccharomyces cerevisiae strain using global transcription machinery engineering (gTME). Large-scale recombination will be performed, and multi-scale phenotypic mutation library will be constructed, due to key transcription factor random mutation by random segments exchange. Lead will be selected as the screening stress, and the strains of high tolerance to heavy metal will be obtained with multiple times of directed screening. Differential genes associated with lead-tolerance will be found when comparing several mutants with wild type with the combing use of RNA sequencing and phenotype microarrays analysis. Meanwhile, the essential data of corresponding gene exression and regulation mechanism will be obtained, and the molecular mechanism of heavy metal resistance of Saccharomyces cerevisiae mutant strains will be analyzed. This research not only generates new idea for the genetic modification of tolerant microbial cellular factories, but also lays a solid theoretical foundation and offers technical support for the industrial application of microbial remediation of heavy metal.

生物修复治理化工行业重金属污染一直是生物化工研究领域的热门课题。酵母是重金属生物修复的最理想微生物之一，具有多种优良特性，但依然存在重金属抗性差的缺点。针对这一问题，本项目以模式真核生物酿酒酵母为出发菌，采用面向RNA聚合酶的全局转录机器工程这一定向进化新策略，通过引入随机片段交换法对影响RNA聚合酶与启动子结合偏好性和结合效率的关键转录因子随机突变，从而对细胞整体转录进行大规模的重组，构建多尺度细胞表型突变文库，以化工行业引起的典型重金属污染物铅为筛选压力，多轮定向筛选获得高抗铅的酵母突变株；进而联用RNA测序技术和表型芯片技术的交互式和可视化分析，鉴定原始菌和突变株中与重金属抗性相关的差异基因，获得相关基因表达水平及调控机理的基础数据，解析酿酒酵母突变株重金属抗逆的分子机制。本研究既为抗逆微生物细胞工厂的遗传改造提供新思路，又为重金属微生物修复的工业化应用奠定了坚实的理论基础。

生物修复治理重金属污染成为当今全球范围内的热门课题。酵母是重金属生物修复的最理想微生物之一，具有多种优良特性，但依然存在重金属抗性差的缺点。针对这一问题，本项目以模式真核生物酿酒酵母为出发菌，采用全局转录机器工程这一定向进化新策略，通过引入随机片段交换法对影响RNA聚合酶与启动子结合偏好性和结合效率的关键转录因子随机突变，成功构建转录因子SPT3的105的随机突变文库，并以重金属铅为筛选压力，经过3轮定向筛选获得6株高抗铅的酵母突变株；联用RNA测序技术和表型芯片技术的交互式分析，鉴定出一批与重金属抗性相关的差异基因，获得相关基因表达水平及调控机理的基础数据；并重点对其中的应激性代谢物海藻糖相关合成基因进行深入研究，运用分子模拟和现代仪器分析技术探讨了海藻糖分子的蛋白质保护作用机制。该研究策略成功拓展至原核模式微生物大肠杆菌中，构建了7株抗酸大肠杆菌工程菌，并解析了大肠杆菌耐酸抗逆机制，为抗逆微生物细胞工厂的遗传改造提供新思路。此外，开展了抗铅突变酵母治理铅污染土壤的应用基础研究，获得了酵母治理土壤污染的实际应用相关数据和经验，同时建立了抗铅突变酵母吸附重金属铅模型，为重金属微生物修复的工业化应用奠定了坚实的理论基础。本项目共计发表研究论文12篇，其中3篇收录在工程技术类SCI一区期刊，申请国家发明专利6项，在国内外学术会议发表研究成果3次，培养硕士研究生6名，完成省部级鉴定成果1项，获得省部级科技进步二等奖1项。