SEPP1基因在肝癌细胞增殖和侵袭中的作用及预知子下调该基因的分子机制

The primary live cancer (PLC) is refractory malignant tumor in China, which with high case fatality, invasion,metastasis and recurrence post operation are the main cause of death. The development of comprehensive therapy is the important future direction and Traditional Chinese Medicine (TCM) has shown advantages in prevention and decrease rates of recurrence and metastasis. In our previous study, we found that, one herb called Akebia Fructus, the common used member in clinical herbal formula which principled of promoting qi to activate blood for PLC, showed the ability of inhibiting proliferation in several kinds of hepatoma cells and alleviate adhesion in HepG2 cells, and influencing some genes in integrin-mediated cell adhesion pathway such as SEPP1, which with the highest expression and was down regulated significantly! We speculate that SEPP1 is one key gene of Akebia Fructus’ effect. In view of this, various drugs (Akebia Fructus extract and one of its composition, saponin E), the inhibitor of this cell adhesion pathway which SEPP1 in (cilengitide, integrin inhibitor), and two hepatoma cells (HepG2 and HuH7) will be used, then some methods including RNAi, MTT, Transwell assay, FCM, Electron Microscope, RTqPCR and Western Blot will be taken in further study. This project aims to observe the role of SEPP1 in the proliferation and invasion of hepatoma cells and the partial suppression mechanism by Akebia Fructus.

原发性肝癌是我国难治性恶性肿瘤，病死率高，肿瘤引发的侵袭、转移和复发是致死的主要原因，发展包含中医药在内的综合治疗方案是其重要发展方向，而中医药在预防和降低肝癌复发转移率等方面具有独特优势。课题组前期研究发现，中医临床治疗肝癌行气活血治法中，常用中药预知子提取物能抑制多种肝癌细胞的恶性增殖，减少HepG2细胞间的相互黏附，影响整合素介导细胞黏附通路，且通路中最高表达量基因──SEPP1出现对应性的显著下降，推测是以上现象发生的关键分子。因此，本研究拟采用不同的干预中药（预知子及其成分）、SEPP1所在通路的抑制剂（抗整合素试剂西仑吉肽），及不同肝癌细胞株（HepG2和HuH7）开展体外实验，并借助于RNAi、MTT、Transwell小室侵袭检测、流式细胞、电镜、RTqPCR、Western blot等技术，揭示Sepp1基因在肝癌细胞增殖及侵袭中的作用，及预知子下调该基因的部分分子机制。

中医药在预防和降低肝癌复发转移率等方面具有独特优势。课题组前期发现，行气活血中药预知子能抑制肝癌细胞的恶性增殖，减少HepG2细胞间的相互黏附，影响Intergin介导细胞黏附通路上SEPP1等诸多基因表达。本项目拟进一步明确SEPP1等基因在肝癌细胞增殖及侵袭中的作用，及预知子（ATKSE）作用产生的分子机制。研究发现：.（1）SEPP1基因表达抑制后，HEPG2、HUH7肝癌细胞增殖能力并未受到显著影响；HEPG2平板克隆形成能力未受影响，但HUH7有被抑制现象；HEPG2侵袭和迁移能力并未受到显著影响，且药物作用并未缩小或放大这种影响。.（2）ATKSE能显著抑制不同肝癌细胞的增殖（0.9~3.0 mg/ml）；在低剂量下（0.25~1.0 mg/ml），能抑制肝癌细胞的黏附、侵袭和转移，且存在量效关系；一些转移相关的经典分子或通路，FAK 黏附通路、cadherin黏附分子、MAPK通路、MMPs参与了该过程。同时，在不同的细胞系中，共性和差异并存：典型如p-FAK在HEPG2和SMMC7721中下调，但是在HUH7中却上调。.（3）在HEPG2细胞中，预知子与CIL联用后，在细胞的增殖、黏附和迁移抑制等方面，未出现显著的减量增效趋势；但是在侵袭能力抑制上该趋势却存在；电镜结果显示，ATKSE和CIL均能影响细胞间的纤毛形态，CIL效果更明显，ATKSE更多体现内质网应激特征；PCR结果显示SEPP1基因表达量显著降低，ITGB1等整合素类5个基因却出现上调趋势；WB结果显示ITGA2、ITGB5、ITGAV、p-FAK和p-ERK1/2均出现下调趋势，其中ITGA2、ITGB5和p-ERK1/2存在和CIL减量增效的趋势；SEPP1蛋白表达未出现显著变化。 .（4）FAK抑制剂与ATKSE联用后，HEPG2和HUH7细胞中的侵袭和迁移抑制效果增强，而在SMMC7721中却出现拮抗效果。提示在后续研究中，在HEPG2细胞系中围绕FAK及其上下游分子如p-ERK1/2的研究可能更具意义。.（5）SEPP1基因和蛋白表达层面上的变化，可能更多是一种被动的、从属现象，即并非预知子作用产生的主要机制或靶点。 .本项目按计划完成了既定研究内容，且有一定的拓展。进一步明确了中药预知子对肝癌细胞增殖、侵袭和转移的影响及分子机制，初步揭示了拟解决的关键学科问题。