甲状旁腺激素相关肽的核定位序列和C末端在骨形成中的作用及机制研究

为了明确甲状旁腺激素相关肽（PTHrP）核定位序列（NLS）和C-末端（PTHrP87-139）是否具有促进骨形成的作用，拟利用我们建立的PTHrP NLS和C-末端缺失（PTHrP KI）小鼠作为研究对象，从形态和分子水平比较分析在PTHrP NLS和C-末端缺失的情况下小鼠长骨的表型差异；拟利用基因重组技术制备小鼠PTHrP87-139蛋白，处理WT、PTHrP基因敲除（PTHrP KO）和KI小鼠的成骨细胞，观察PTHrP87-139能否促进WT、PTHrP KO和KI小鼠成骨细胞的增殖和活化。利用PTHrP87-139干预新生同窝WT和KI小鼠，观察PTHrP87-139能否纠正KI小鼠的表型。在此基础上再利用PTHrP87-139蛋白干预骨质疏松模型小鼠，在体观察其能否纠正骨质疏松的表型，借此以明确PTHrP87-139促进骨形成的可能机制。

为了研究PTHrP NLS和C-末端的缺失引起小鼠骨质疏松表型的机制，我们利用组织学、组织化学、免疫组织化学、real-time RT-PCR及Western blots等方法，比较分析了E18.5天PTHrP KI胚鼠与同窝WT 胚鼠的骨骼表型差异。结果显示:PTHrP NLS和C-末端缺失能够通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞分化而引起软骨发育障碍。并且这种骨质疏松的表型是由于PTHrP NLS和C-末端的缺失抑制了成骨细胞骨形成，而不是通过刺激破骨细胞骨吸收导致的。.为了研究PTHrP NLS和C-末端在抗骨质疏松中的作用及机制，我们利用基因工程的方法构建了PTHrP87-139(含有NLS和C-末端)表达质粒PGEX-2TK-PTHrP87-139，转入大肠杆菌BL21中，IPTG诱导蛋白大量表达，利用GST亲和纯化系统纯化蛋白。通过Western blot证明我们纯化的基因重组PTHrP87-139蛋白具有免疫学活性。为了明确外源性PTHrP87-139蛋白是否能够进入细胞核，利用我们重组的PTHrP87-139处理PTHrP KI小鼠来源的骨髓间充质干细胞(BM-MSCs), PBS作为对照，通过PTHrP C-末端免疫荧光染色的方法，检测了PTHrP87-139的亚细胞定位。结果显示外源性PTHrP87-139能够进入细胞核。.为了研究外源性小鼠PTHrP87-139在促进BM-MSC增殖和分化中的作用及机制，利用我们基因重组的PTHrP87-139处理WT或PTHrP KI小鼠来源的骨髓细胞，通过细胞化学染色、PI单染或Annexin V 和PI双染以及Western blot和real-time RT-PCR检测BM-MSC向成骨细胞分化的主控基因Runx2、原癌基因Bmi-1和细胞周期抑制因子p16、p21和p27表达水平的改变，观察了外源性PTHrP87-139对BM-MSC成纤维细胞集落形成单位（CFU-f）和碱性磷酸酶染色阳性克隆（CFU-fap）形成效率、骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及细胞周期的调控分子表达的影响。结果显示：外源性 PTHrP87-139能够通过上调Runx2和Bmi-1，下调p16、p21和p27，发挥促进BM-MSC增殖和向成骨细胞分化，抑制其凋亡的作用。.为了明确外源性PTHrP87-139是否能矫正PTHrP KI小