罗布麻提取物对急性脑缺血后血脑屏障的保护作用和机制研究

We previously reported the neuroprotective effects of Apocynum venetum leaf extract (AVLE) in vivo and in vitro. What draw our attention is that AVLE protects the blood brain barrier (BBB) against structure disruption induced by cerebral ischemia in a rat model of stroke, and the mechanism is related to its inhibition on expression and active of metal matrixprotease(MMP)-9 and -2. However, the effects and mechanisms mentioned above are urgent to further be tested and verified. Thus, present study is aimed to evaluate the protective effects of AVLE on BBB against cerebral ischemic injury in a spontaneously hypertensive rat model of cerebral ischemia injury; and to explore the key mechanisms underling the protection of AVLE from JAK2/STAT3 parthway (the up-stream pathway of MMP-9/-2) and the components of BBB (the down-stream targets of MMP-9/-2). In all, our study will provide new evidence for AVLE in treatment of cerebral ischemic disease.

我们前期的体内和体外研究表明罗布麻提取物具有较好的神经保护作用。引起我们注意的是，在电镜下观察到罗布麻提取物可显著减轻缺血引起的血脑屏障超微结构破坏，其机制可能与下调基质金属蛋白酶-9/-2的表达和活性有关。但上述保护作用及机制尚有待更全面的证据支持。因此，本项目拟利用自发性高血压大鼠建立脑缺血损伤模型，从结构和功能两方面，进一步评价罗布麻提取物对血脑屏障的保护作用；从上游的JAK2/STAT3信号通路追溯罗布麻提取物调控基质金属蛋白酶-9/-2表达和活性的"分子开关"，从下游的血脑屏障结构成分（星形胶质细胞、脑血管内皮细胞、紧密连接等）探讨罗布麻提取物的保护作用靶点，为罗布麻在脑缺血性疾病的应用提供科学依据。

本研究目的在于探讨罗布麻提取物对急性脑缺血后血脑屏障的保护作用及其机制。分为三个部分：.第一部分 罗布麻提取物的脑缺血保护作用及量效关系研究。大鼠随机分为：假手术组、模型组、罗布麻提取物125mg/kg/d、250mg/kg/d、500mg/kg/d剂量组。采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血损伤模型，1.5h后拔出线栓实施再灌注。采用TTC染色计算脑梗死面积百分比；参照Zea Longa评分标准进行神经功能缺损评分。结果发现500mg/kg/d罗布麻提取物能显著减少脑梗死面积百分比，改善神经功能缺损，具有最优脑缺血保护效果。.第二部分 罗布麻提取物对血脑屏障的保护作用和机制研究。我们选取500mg/kg/d罗布麻提取物观察其对血脑屏障的保护作用，观察观察指标包括：透射电镜检测血脑屏障超微结构变化；免疫荧光观察活化的星形胶质细胞以及脑血微血管数量和结构变化；干湿重法观察脑水肿；尾静脉注射伊文斯兰及其渗出实验观察血脑屏障通透性改变；MRI验证脑梗死体积、脑水肿程度、以及血脑屏障破坏。western blot 和明胶酶谱实验检测脑缺血后基质金属蛋白酶-9/-2表达和活性的变化。结果500mg/kg/d罗布麻提取物可显著抑制星形胶质细胞活化、脑血微血管损伤；减轻血脑屏障超微结构破坏、抑制血脑屏障通透性增高，进而减轻脑水肿。表明罗布麻提取对血脑屏障结构和功能的保护作用。上述保护作用与罗布麻提取物对脑缺血后基质金属蛋白酶-9/-2表达和活性的抑制有关。.第三部分 罗布麻提取物的抗氧化作用和机制研究。大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、500mg/kg/d罗布麻提取物组（AVLE）、AVLE+AG490组、AVLE+DMSO组。采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血损伤模型，1.5h后拔出线栓实施再灌注。利用Nissl染色和TUNEL染色检测细胞损伤和凋亡，MDA检测脂质过氧化反应，western blot检测Jak2、STAT3、MnSOD的表达。结果发现罗布麻显著减轻脑缺血后的氧化应激反应，减少细胞损伤和凋亡，上调STAT3通路的表达，而采用AG490抑制Jak2后，其下游的STAT3表达被被抑制，MnSOD的表达下调，抗氧化及神经保护作用被抵消。表明罗布麻提取物可能通过Jak2/STAT3通路调控MnSOD的表达而发挥抗氧化和脑保护作用。