基于“中心代谢途径偶联”的代谢改造及适配性研究

Central metabolic pathways provide precursors for chemicals biosynthesis. However, precursor competition between synthetic pathway and the central metabolic pathways restrict the yield of target product. To resolve this problem, we develop a strategy called "center metabolic pathways coupling" in which the reaction of the biosynthesis pathway is "embedded" in center metabolic pathways, so as to achieve the biosynthetic pathway and cell metabolic pathway coupling. By the pathways coupling, the target product synthetic pathway is necessary for the cell growth. Metabolic strategy of "central metabolic pathways coupling" takes advantage of the flux of central metabolic pathways to solve the problem of precursor competition and will result in improved production of target product. In this study, the reaction catalyzed by proline-4-hydroxylase for biosynthesis of trans-4-Hydroxy-L-proline will be coupled with the central metabolic pathways in E.coli, to demonstrate the feasibility of strategy "central metabolic pathways coupling" in the 2-oxoglutarate dependent dioxygenase catalyzed reactions. By the "central metabolic pathways coupling", the 2-oxoglutarate, a substrate of the hydroxylase catalyzed reaction will be changed to be the cofactor of the reaction and recycled by central metabolic pathway, which may lead to improved enzymatic efficiency and the enhanced production of target product. By studying the influence between the chassis E. coli and the "central metabolic pathways coupling" synthesis module, the adaptation mechanism will be revealed. The results will not only improve the yield of target product but also provide the theoretical guidance for metabolic engineering of the product which biosynthetic pathway is associated with TCA cycle.

中心代谢途径是许多化合物合成的前体来源，合成途径与中心代谢途径之间存在前体竞争，限制了产物合成水平的提高。针对该问题，我们提出“中心代谢途径偶联”的改造策略，即将合成途径的反应“嵌入”中心代谢途径，从而实现目标产物合成与细胞中心代谢的偶联，使目标产物的合成途径成为了细胞维持中心代谢所必需的反应，解决前体竞争问题，有利于目标产物合成水平的提高。拟以脯氨酸羟化酶催化反应为例，在大肠杆菌中设计2-酮戊二酸依赖型酶通用的“中心代谢途径偶联”策略，解决前体2-酮戊二酸供应和再生问题，提高酶催化效率和产物合成水平。并进一步通过研究大肠杆菌底盘细胞对偶联的合成模块的适应机制，以及底盘细胞对合成模块的影响，揭示底盘细胞与“中心代谢途径偶联”的合成模块适配性规律。“中心代谢途径偶联”及其与底盘细胞适配性规律的研究，不仅有利用目标产物的高水平合成，也将为其他与TCA循环有关联的合成代谢改造提供理论依据。

中心代谢途径是许多化合物合成的前体来源，合成途径与中心代谢途径之间存在前体竞争，限制了产物合成水平的提高。针对该问题，我们提出“中心代谢途径偶联”的改造策略，即将合成途径的反应“嵌入”中心代谢途径，从而实现目标产物合成与细胞中心代谢的偶联，使目标产物的合成途径成为了细胞维持中心代谢所必需的反应，解决前体竞争问题，有利于目标产物合成水平的提高。.我们以脯氨酸羟化酶催化反应为例，在大肠杆菌中设计2-酮戊二酸依赖型酶通用的“中心代谢途径偶联”策略，将α-酮戊二酸（2-OG）依赖型酶反应与中心代谢途径藕联，解决反应所需的2-OG供应和再生问题，提高酶催化效率和产物合成水平。利用优化的大肠杆菌底盘，获得羟脯氨酸合成水平提高的大肠杆菌工程菌株。为了解决影响底盘细胞与“中心代谢途径偶联”的合成模块适配性的关键问题，我们对菌株进行了适应性进化，对进化前后的菌株，通过代谢流、基因组测序、转录组数据分析，分析影响底盘细胞与“中心代谢途径偶联”的合成模块适配性的关键因素，揭示底盘细胞与“中心代谢途径偶联”的合成模块适配性规律。并通过反向代谢工程构建了无TCA循环的底盘细胞，该底盘适用于2-酮戊二酸依赖型的羟化酶合成反应，具备即插即用的通配性。该底盘将来可以应用到依赖于α-酮戊二酸的化学品合成生物细胞工厂构建工作中，具有良好的应用潜力。.“中心代谢途径偶联”及其与底盘细胞适配性规律的研究，不仅有利用目标产物的高水平合成，也将为其他与TCA循环有关联的合成代谢改造提供理论依据。本研究建立的无TCA底盘可以应用到依赖于TCA中间产物为前体的化学品合成生物细胞工厂构建工作中，同时该底盘可以完全不依赖TCA循环进行好氧生长，从而可以减少碳丢失，提高底物的理论转化率，有优良的碳经济性，具有重要的科学和实际意义。