构建基于核酸酶辅助信号放大策略的可卡因可视化传感器

The abuse of cocaine leads to not only adverse health consequences but also endangers others, harming society. The rapid, on-site screening of cocaine is important for detoxification, drug control, the fight against drug-related crime and safeguarding social stability. Currently, the screening of cocaine is based on competitive immunoassay, and it usually takes the form of antibody-based test strips. Unfortunately, these immunoassay-based devices have the disadvantages inherited from the employed antibody such as poor specificity, high cross-reactivity, and batch-to-batch variation. The specific aim of this study is to develop a highly sensitive and specific, colorimetric aptamer-based sensor for rapid, on-site detection of cocaine in body fluids. Firstly, a high sensitivity is achieved by cocaine target recycling based on a specific recognition and digestion of nuclease on cocaine/aptamer complexes. Secondly, a new gold nanoparticle (AuNP) based colorimetric sensor (detection of limit below 15 ng/mL) is developed based on the product-resulted stability changes of modified AuNP in the absence or presence of cocaine. Thirdly, a nuclease-immobilized, micro-fluidic chip will be designed and fabricated to perform colorimetric on-site detection of cocaine in saliva and urine. We expect that our sensor platform and device can a successful prototype for developing/improving the screening of other drugs of abuse with high sensitive and specificity.

滥用可卡因不仅危害个人健康，而且危害他人，影响社会安全。因此，对疑似吸食可卡因人员的现场检测在戒毒、禁毒、打击毒品犯罪和维护社会治安等方面都有着极其重要的意义。目前，用于现场检测可卡因的产品多是基于免疫竞争法的检测试纸。这类试纸具有免疫分析法的通病，比如：灵敏度低、存在假阳性和批次间差异等。本项目拟构建一种高灵敏度、高特异性的可视化适配体传感器，用于体液中可卡因的快速检测。主要研究内容包括：首先，使用核酸酶特异性识别由可卡因引起其适配体的结构变化并酶解适配体，实现可卡因的循环利用，为构建高灵敏度传感器提供理论依据；其次，根据有、无可卡因时，适配体经酶解后链长不同对其所修饰纳米金稳定性的影响，构建一种高灵敏（检测限低于15 ng/mL）的可视化传感器；最后，构建固定核酸酶的便携式微流控芯片传感器，实现对唾液、尿液中可卡因的快速可视化检测。所构建的检测方法有望为其它毒品小分子的检测提供借鉴。

对疑似吸食可卡因人员的现场检测在戒毒，禁毒，打击毒品犯罪和维护社会安定等方面上都有着及其重要的意义。本项目拟借助核酸外切酶辅助策略实现靶标循环使用从而提高检测灵敏度。但实验中，我们发现具有Y型结构的可卡因适配体在结合可卡因后实际上是抑制核酸外切酶III的酶解活性，并得到一个同样能够结合可卡因的长链酶解产物。接着，我们在另外一个具有Y型结构的脱氢表雄酮适配体以及具有茎环结构的三磷酸腺苷适配体上都发现了这种抑制核酸外切酶III酶解活性的现象。基于这种现象，我们构建了一种非标记的荧光传感器能够在20分钟内完成对唾液中可卡因的检测，检测限为1 μM。此外，我们研究发现这些酶解产物不但具有靶标诱导构型变化的功能，而且具备不逊于完整适配体的亲和力。我们使用相关的酶解产物成功构建了用于检测可卡因的电化学适配体传感器和用于检测三磷酸腺苷的荧光适配体传感器。这说明我们提出的核酸酶外切酶III的酶解策略作用在Y型结构的和茎环结构的适配体能够产生具有靶标诱导构型变换功能的新适配体，这为相关传感器的构建提供了功能性的适配体原件。进一步的研究还表明这些主要酶解产物在结合靶标分子时还能抑制核酸外切酶I的酶解活性。我们使用上述两种核酸外切酶混合酶解的方法构建了一种非标记的荧光传感器，其能够在15分钟内完成对尿液中脱氢表雄酮的检测，检测限为0.5 μM。基于这种双酶解策略，我们结合分子信标技术构建了一种同时检测可卡因和三磷酸想的荧光传感器，该方法能够在25分钟内完成上述两种目标的同时检测。最后，我们还发现这种核酸外切酶I的活性抑制现象同样发生在具有赭曲霉毒素A诱导形成 G四倍体结构功能的赭曲霉毒素A适配体上。由此，我们使用具有DNA酶活性的氯高铁血红素适配体结合氯高铁血红素时催化产生的氧化物刻蚀纳米金棒的方法构建了一种多色可视化传感器用于裸眼半定量检测啤酒中的赭曲霉毒素A。