集基因转染、生物活性分子输送与蛋白质纯化的多功能石墨烯载体的构建及功能研究

Investigation of protein-protein interactions improves our understanding of diseases and provides the basis for new therapeutic approaches. The current protein interaction studies need several consecutive steps, including gene transfection, bio-active molecular delivery, and protein purification, followed by structural studies. Such a complicate process is time consuming, and can be influenced by many factors. Moreover, the cells and proteins may be at different stage/status when carrying out these separate steps. Therefore, a lot of intra-cellular processes can not be accurately described and may even lead to incorrect conclusions. However, the current research efforts mainly focus on improving the performance of the individual process, not to make them synchronized. .Graphene, a single layer of carbon atoms in a 2?d close packed honeycomb lattice, has been applied in the fields of gene transfection, drug delivery, and protein purification, respectively. Recently, the applicant developed a highly efficient graphene gene transfection reagent with low toxicity, and also using graphene the applicant achieved fast protein purification. Here based on the previous result, the applicant proposes to (1) combine the functions of gene transfection, bio-active molecular delivery, and protein purification into one single graphene cargo by multiply functionalizing graphene; (2) find out the fundamental correlations between the cargo performance and graphene functionalization method; (3) validate the usefulness of this approach in protein interaction studies.

从分子层面研究蛋白质作用机制是了解各种生命活动和疾病发病机制的重要手段，为药物设计和疾病治疗提供理论指导。目前的研究流程包括基因转染、生物活性分子运载、蛋白质纯化等步骤。该流程繁杂、影响因素多、细胞和蛋白质的结构与功能状态不易控制，这极大的制约了蛋白质作用机制的研究。石墨烯是由单层碳原子形成的二维纳米材料，可分别应用于药物运载、基因转染、和蛋白质纯化领域。在前期工作中，申请者开发出了高效、低毒的石墨烯基因转染试剂和蛋白质纯化试剂。本项目将：1）开发出基因转染、生物活性分子输送、和蛋白质纯化高效率、低毒性多功能载体，2）寻找影响该载体的各种性能的关键因素，探索功能化方法与载体性能之间存在的规律，3）改进修饰方法，优化载体性能，使多步操作一步完成，简化蛋白质作用机制的研究流程。本项目的成功将强有力的推动蛋白质作用机制的研究，取得该领域方法学上的重大突破，具有重要的学术价值和重大的社会意义。

从分子水平揭示蛋白质复合物的三维结构是蛋白质相互作用研究中的核心方向，这对于理解生物调控机制等生命活动规律至关重要。蛋白质复合物结构研究流程通常为通过基因转染在人类细胞中表达目标蛋白质，并形成复合物，通过纯化步骤得到该复合物，然后对其进行结构解析。整个操作过程，各个操作步骤相互分开，蛋白质复合物的结构和功能在这个过程中很容易发生变化，这已经成为阻碍该领域发展的一个瓶颈。.本项目正是在前期工作基础上建立了一个全新的方法学体系，设计并构建出集高效基因转染、活性分子运载和快速蛋白质纯化功能于一体的多功能载体，使多步操作一步完成。可大大简化蛋白质作用机制的研究流程，突破蛋白质复合物结构研究中的瓶颈，既有学术理论价值，又可产生巨大的经济效益。..1. 本项目任务书的研发内容如下：.基于石墨烯，开发可完成基因转染、活性分子运载、蛋白质纯化与分离的多功能载体；改善功能化方案，提高载体的各种性能；简化蛋白质复合物研究的流程。.2. 本项目的主要研究成果：.(1)成功开发出基于石墨烯的多功能载体。对单细胞状态的斑马鱼卵使用膜间进行注射转染发现，该转染试剂可达90%的阳性转染效果，鱼卵存活率亦达到80%以上。（发表于Nano Res. 2012）.(2)开发出了可同时完成基因转染和细胞内追踪的高效低毒石墨烯载体，对进一步理解基因转染与运载和产业化研究具有指导意义。（已发表J. Mater. Chem. B, 2013）.(3)石墨烯蛋白分离产品已经完成包括强酸型、弱碱型、强碱型蛋白分离纯化试剂三大系列。与市场上传统技术相比，具有负载量高；速度快，分离纯化速度五分钟左右即可完成；纯度高，蛋白纯度超过90%；操作简便，成本低，条件温和，纯化规模大等优势。.(4) 采用生物体内天然纳米粒子进行了基因转染。相比纯的PEI基因转染体系，可以实现基因转染效率的大幅度提高（最高提高500%）。48h最佳转染效率达到80%，并保持低毒性（细胞存活率大于90%）。文章已发表。. (5) 开发了非阳离子的特异性基因负载技术。将碳纳米管表面进行修饰生物识别分子对，在基因端部修饰生物素，实现碳纳米管与基因的特异性负载。可用于新一代蛋白质相互作用研究与基因转染试剂的研究与开发。已发表。.3.本项目获得的知识产权成果.共撰写和发表SCI论文5篇，其中Science一篇。申请发明专利2项。