基于纳米荧光探针的免疫层析检测法的研究

建立快速灵敏的食品安全现场检测方法是目前国内外共同关注的重点和热点。本项目拟在前期工作的基础上，创新性地以纳米荧光探针为检测工具，探索建立一种速度快、灵敏度高的食品安全现场检测方法。通过制备高质量的纳米荧光微球，对其表面进行修饰后,将其与高亲和力、高特异性、高效价的抗盐酸克仑特罗的单克隆抗体进行有效偶联，摸索到既可以保持纳米荧光微球的荧光强度，同时又保持单克隆抗体生物活性的有效的偶联方法。以免疫层析技术为载体，以竞争抑制为检测原理，实现盐酸克仑特罗残留的快速、高灵敏度现场检测,并推广至食品安全快速检测的其它领域。基于纳米荧光探针的免疫层析检测法，有望解决食品安全现场检测方法灵敏度偏低，使用范围受限制的技术瓶颈，为丰富和优化我国食品安全快速检测方法提供新的思路，为改善和提高我国食品安全质量提供有力的技术支撑。

克仑特罗是一种扩张气管治疗哮喘的药，因为它可以提高动物的生长速度和瘦肉率，因此曾经被广泛应用于畜牧生产中。然而食用残留克仑特罗的动物性食物对人体有害，我国和欧盟都已明令禁止在畜牧生产中使用克仑特罗。目前克仑特罗常用的检测方法有液／质联用法 、气／质联用法和酶联免疫吸附法。虽然这些方法的灵敏度较高，但检测时间较长，需要熟练的操作人员和复杂的仪器设备。以胶体金为标记物的免疫层析法具有一步加样、便捷、结果判断直观、经济、不需特殊设备的特点。本课题组在前期工作中成功建立了克仑特罗胶体金检测方法。然而这种方法的灵敏度较低，从而限制了其在食品安全领域的应用。在本研究中，我们选择荧光微球作为标记物，以建立一种灵敏度更好的免疫层析方法。通过碳二亚胺法，荧光微球表面的羧基与抗克仑特罗的单克隆抗体结合，应用扫描电镜、荧光分光光度计、纳米粒度仪和凝胶电泳对其进行表征并提示偶联状况。通过荧光微球试纸条读取仪对试纸条的检测线（T线）和质控线（C线）的荧光强度进行扫描，对所制备的荧光微球免疫层析试纸条进行荧光强度动力学分析。同时，样品的加样方式也进行了比对，一种是直接将样本加到荧光微球免疫层析试纸条的加样孔中，另一种是在酶标孔中预先加入荧光微球抗体复合物，加入样本充分混合后再加到荧光微球免疫层析试纸条的加样孔中。结果显示，基于纳米荧光探针的免疫层析T线和C线的荧光强度在55分钟内都持续增强，T/C比在30分钟内可达到平衡。以T/C比读数，在酶标孔中加样，不仅可以提高荧光微球免疫层析试纸条的灵敏度，而且可以减低其变异系数。优化条件后，试纸条的IC50值为0.12 ng/ml，在猪尿中的最低检测限为0.01 ng/mL，与酶联免疫吸附法的结果一致，从而成功地建立了克仑特罗残留的快速、高灵敏度的现场定量检测方法。