呼吸链复合物I相关线粒体基因突变与肺腺癌转移的相关性研究

新近研究显示编码呼吸链复合物I亚基6的线粒体基因突变可导致呼吸链复合物I活性丧失并增强肿瘤细胞的转移能力。但其他呼吸链复合物I相关线粒体基因突变对肿瘤细胞转移能力的影响尚不明确。此外，鉴于目前研究仅限于对小鼠肿瘤细胞株的实验研究，因此，有关呼吸链复合物I线粒体相关基因突变与人肿瘤转移的相关性还有待于进一步的临床研究证实。肺腺癌是临床高发的恶性肿瘤，术后肿瘤转移是导致肺腺癌患者死亡的主要原因。国外报道及我们的前期研究均显示肺腺癌存在高频率的线粒体基因突变。为此，本项目拟参照国外同类研究的实验方法，在构建线粒体-细胞核杂合细胞的基础上，通过相关的体内外实验明确呼吸链复合物I相关线粒体基因突变对肺腺癌细胞转移能力的影响。同时，我们还将进一步通过临床统计分析的方法对呼吸链复合物I相关线粒体基因突变与临床肺腺癌转移的关联性作出明确的判断。本项目如获成功，将对阐明肺腺癌转移发生机制起到积极的推动作用。

线粒体是真核生物细胞中重要的细胞器。研究表明，线粒体在合成ATP为细胞提供能量的同时，可产生活性氧(ROS)并籍此调节细胞的氧化还原电势和信号转导，进而调控细胞对氧化应激、凋亡、基因表达等多种生理反应。我们取87例肺腺癌患者的肿瘤组织及对应的正常组织，抽提线粒体DNA；通过PCR扩增ND基因序列后进行测序检测，对照正常组织中的ND6基因序列，确定肿瘤组织中ND6基因序列包含的突变位点；分析突变类型（无义、错义和沉默突变），并计算突变发生率。构建细胞核线粒体杂合细胞，检测线粒体ND基因突变对肺腺癌细胞生物学活性的影响。收集肺腺癌患者的临床资料，统计分析ND6基因错义(及沉默)突变与肺腺癌临床病理因素的相关性。.在87例原代肺腺癌样本中，19例检测到ND6基因突变，点突变发生率达到21.3%；其中8例为无义突变，8例为错义突变，3例为沉默突变，导致ND6蛋白序列发生改变的错义及沉默突变发生率为12.4%。临床统计分析结果显示，ND6基因突变与病理类型、淋巴结转移及血管侵袭等显著正相关，但与患者年龄、性别、肿瘤发生部位、肿瘤直径等无相关性。.以含ND6基因错义(或沉默)突变的原代肺腺癌细胞为线粒体供体，以红色荧光标记的人肺腺癌细胞株A549作为细胞核供体，融合构建线粒体-细胞核杂合细胞。通过单层细胞损伤愈合、Transwell小室实验检测ND6基因错义(或沉默)突变对细胞迁移、侵袭能力的影响。细胞经足垫接种经γ射线辐照预处理的NOD/SCID小鼠，移植A549细胞作为对照，取膝后弯淋巴组织观察淋巴结转移成瘤情况；细胞经尾静脉接种经γ射线辐照预处理的NOD/SCID小鼠，观察脏器转移成瘤情况。结果成功构建线粒体-细胞核杂合细胞。单层细胞损伤愈合结果显示，含ND6基因错义(或沉默)突变的杂合细胞迁移距离显著大于源细胞；Transwell实验结果显示，杂合细胞的迁移细胞率显著高于源细胞；Matrigel包被的Transwell实验结果显示，杂合细胞的侵袭细胞率显著高于源细胞。杂合细胞导致免疫缺陷小鼠淋巴结转移成瘤以及脏器转移成瘤的比例显著高于源细胞株。.我们的研究结果提示，肺腺癌癌组织中线粒体ND基因发生高频率的点突变，且与临床肿瘤侵袭转移发生相关。线粒体ND6基因突变可通过抑制细胞呼吸链复合物I活性的途径促肺腺癌细胞迁移及侵袭进而导致转移。