HCN通道功能抑制对脑缺血的保护作用及相关分子机制研究

Brain ischemia usually initiates endogenous neuroprotection responses. In our previous work, we have found that chronic brain ischemia can cause a significant decrease of the mRNA expression level of HCN1, a subunit of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel (HCN channel) in the hippocampus region, whereas pretreatment of HCN channel blocker ZD7288 in the lateral ventricle of the rats can reduce the brain infarction area, ameliorate the neurobehavioral score in the acute brain ischemia of the rats, suggesting that the significant decrease of HCN expression level could be an endogenous protection response for the brain ischemia, and that HCN channel could be a potential target for the brain ischemia treatment. In order to further explore whether the alteration of HCN channel expression level and HCN-mediated current is an endogenous protection response for brain ischemia, we herein establish the in vivo and ex vitro models to study the HCN channel expression level and HCN-mediated current at different time points after the incidence of brain ischemia, and by applying HCN channel blocker, neutralizing antibody and RNAi techniques, we inhibit the HCN channel to study the neurologic injury level after the brain ischemia, and furthermore, to discover the molecular mechanism involved. The present research therefore will provide novel strategy and valuable evidence for the prevention and treatment of ischemic brain diseases.

脑缺血时往往会启动内源性神经保护反应，以实现机体的自身保护。在前期国家自然科学基金的资助下，申请者研究表明慢性脑缺血时海马神经元超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道（HCN通道）亚基HCN1 mRNA转录水平下降，亦发现大鼠侧脑室预先注射HCN通道阻断剂可减少急性脑缺血大鼠脑梗死面积、改善神经行为学评分，故推测脑缺血时HCN通道蛋白亚基表达水平的下调为一种内源性保护机制，HCN通道可作为脑缺血治疗潜在的靶点之一。为探讨HCN通道蛋白亚基表达和HCN通道介导电流的变化是否是神经元在脑缺血时的一种内源性保护机制，建立在体和离体模型，检测脑缺血后不同时间点HCN通道亚基蛋白表达和HCN通道介导电流的变化；应用HCN通道抑制剂和中和抗体以及RNAi技术抑制HCN通道，观察脑缺血后神经元损伤水平的变化并从NMDA受体和凋亡诱导因子途径探讨其细胞分子机制。该研究将为缺血性脑损伤疾病的防治提供新的策略。

实验目的：以超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道（HCN通道）为切入点，探索HCN通道在脑缺血时自身的变化以及HCN通道功能抑制对脑缺血大鼠的神经保护作用，并探究其可能的分子机制，以为缺血性脑血管疾病的防治提供新的思路和途径。.主要实验内容：a.检测脑缺血后不同时间点HCN1-4蛋白和mRNA动态变化情况。b.HCN通道特异性阻断剂ZD7288在整体动物对脑缺血神经保护作用及保护作用时间窗确定；运用siRNA技术在整体动物沉默HCN1、HCN2基因，检测HCN在脑缺血时的病理生理学意义。c.运用水迷宫方法检测ZD7288对脑缺血4周后大鼠学习记忆的影响；运用整体动物电生理技术检测ZD7288对脑缺血4周后大鼠突触传递功能的影响。d.检测脑缺血后不同时间点NR1、NR2A、NR2B、NR3A、NR3B蛋白和mRNA变化情况。e.检测脑缺血后不同时间点Fas-L、Caspase-3、AIF、bcl-2、bax、p53蛋白和mRNA变化情况。.实验结果：急性脑缺血再灌注发生后， HCN1、HCN2通道蛋白和 mRNA的表达以及HCN3、HCN4 mRNA的表达在皮层和海马CA1、CA3、DG区均发生了不同程度的变化，而HCN3，HCN4蛋白表达无明显变化，说明主要HCN1和HCN2通道参与了脑缺血发生发展的病理生理学过程。15 μg和20 μg具有神经保护效应，25 μg效果最为显著；HCN1、HCN2基因沉默动物行脑缺血再灌注手术后，TTC染色发现脑梗死面积显著减小；缺血16h为ZD788脑缺血保护的时间窗，缺血前2h 预防性给药的治疗效果最为明显。在缺血2h再灌注4周大鼠，ZD7288可显著改善脑缺血大鼠受损的学习记忆功能，改善突触可塑性。脑缺血后，在皮层和海马不同区域，兴奋毒分子NR1、NR2A、NR2B、NR3A、NR3B和凋亡相关分子Fas-L、Caspase-3、AIF、bcl-2、p53发生不同变化，HCN通道功能抑制上述分子具有调节作用。.结论：脑缺血时HCN通道功能抑制具有神经保护作用，具体分子机制涉及兴奋毒相关分子NR1、NR2A、NR2B、NR3A、NR3B和凋亡相关分子Fas-L、Caspase-3、AIF、bcl-2、p53。.科学意义：本研究结果为缺血性脑血管疾病的防治提供了新的思路和途径，将有助于发现新的有效的药物作用靶点，为缺血性脑损伤疾病的