对过敏原蛋白有亲和性的温敏性纳米水凝胶的制备及识别机理研究

There are many drawbacks in the preparation and identification of molecularly imprinted technology in biomacromolecule. Based on molecular dynamics simulation results, we will develope methods for synthesizing nano-sized hydrogen particles with highly binding affinity and selectivity to Ara h1, which is the main protein among the peanut allergen. The mild conditions of precipitation polymerization using N-Isopropyl acrylamide (NIPAm) as the backbone monomer in combination with other biocompatible monomers as hydrogen binding, negative charged, positive charged, and hydrophobic functional monomers will be optimal for bio-macromolecular imprinting. These 10-100 nm distribution polymer NPs in aqueous solution have populations of specific recognition sites in robust network polymers. The process of target protein capture and release relies on the temperature change. The peptide “RRYTARLKEG” which is the epitope of Ara h1 will be employed as the template in the further synthesis of NPs in order to improve their detection sensitivity to Ara h1. Fluorescence labeling and Quartz Crystal Microbalance will be used to improve the determination sensitivity. Consequently, the fluorescent signal of NPs can devote to their biotoxicity study in the future research. Furthermore, the microstructure of nano-particles (NPs) and the interaction between NPs and protein Ara h1 will be disclosed by molecular dynamics simulation study together with the experiment results obtained by Isothermal Titration Calorimetry and Surface Plasmon Resonance.

分子印迹技术发展至今，在生物大分子上还存在着从制备到识别的诸多问题。本研究以花生过敏原蛋白Ara h1为目标物，在分子动力学计算的基础上，采用温敏性单体、亲电单体和亲核单体，在水相中制备具有柔性结构的纳米水凝胶颗粒（NPs）。该材料应具有温敏性、粒径小、比表面积大、表面上作用位点多、与目标蛋白有强亲和性等特点。由于NPs具有低临界相变温度（LCST），因此可通过改变温度捕获-释放蛋白。在已优化的NPs制备方案上采用“抗原决定基”印迹法，用RRYTARLKEG肽段为模板进行印迹，进而提高NPs对Ara h1的特异性识别。在亲和性研究中，采用荧光标记单体以及石英晶体微天平以提高检测的灵敏度，采用等温滴定量热和表面等离子共振等手段获取热力学和动力学数据，结合分子动力学计算，获得水凝胶微观结构以及二者亲和识别机理，并预期将该印迹纳米温敏性水凝胶颗粒作为“人工抗体”应用于花生过敏诊断和治疗。

花生过敏性人员仅摄入毫克级别的花生便可引致过敏反应，严重可引发过敏性休克导致死亡。Ara h1 是花生最主要致敏原，能与90%的花生过敏者的血清IgE 结合，且占花生蛋白总量的12%~16%。.本研究以N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm）为骨架，丙烯酸（AAC）等带电性单体，N-叔丁基丙烯酰胺（TBAm）等疏水性单体，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）为交联剂，采用沉淀聚合法在水相中制备一系列粒径可控（50-200 nm）、比表面积大、表面结构可设计、响应迅速、稳定性高，且具有良好生物相容性的智能响应高分子材料纳米水凝胶颗粒（Nanoparticles hydrogel，NPs）库，并着重利用一系列不同配方纳米水凝胶颗粒与花生过敏原蛋白Ara h1的高识别率抗原决定基RRYTARLKEG和DITNPINLREG以及Ara h1蛋白的亲和性进行研究，筛选得到亲和性最佳的配方，再进行亲和条件优化以及亲和机理研究。通过动态光散射原理确定纳米水凝胶颗粒NPs粒径大小、光子相关光谱法表征NPs的稳定性以及扫描电子显微镜确定NPs的表面形貌特征。通过对NPs与多肽段RRYTARLKEG和DITNPINLREG以及Ara h1蛋白的亲和性分别进行研究与定量计算，并结合亲和吸附的环境条件如环境酸碱度、离子强度、温度进行了优化。接下来利用优化后的条件对NPs亲和多肽段与蛋白分别进行了吸附动力学研究与等温吸附研究，拟合计算得到吸附动力学曲线以及等温吸附曲线，初步对吸附机理进行探究。.本研究通过模拟计算单体&单体、单体&交联剂之间连接方式、键能、相对键能、博尔兹曼权重等，实现了对高分子材料聚合前的粗筛，很大程度提高了实验的成功率。此外，模拟计算的加入，更好地揭示了NPs与生物大分子亲和机理。经过合成筛选出的纳米材料，有望作为人工抗体，实现对花生过敏的治疗，同时，本研究方案在生物大分子识别方面具有很大的潜力。