蛴螬中肠围食膜蛋白的分离鉴定及其生化特性分析

金龟子（幼虫统称蛴螬）是农作物、果树和林木的重要害虫，是国内外公认的难防治的土栖性害虫。目前防治蛴螬以化学防治为主，但是长期使用导致其抗药性增强、生态平衡破坏、农产品品质下降，以及环境污染等问题日益突出；生物农药防效慢、成本高。而开发新的生物防治靶标的害虫治理新策略正在成为研究热点。昆虫中肠围食膜是昆虫天然的防御体系，主要由几丁质和蛋白质组成，其中蛋白质成分在保护昆虫消化道免受微生物的入侵上起着重要作用。本研究旨在以蛴螬为研究对象，构建其中肠cDNA表达文库，筛选分离中肠围食膜蛋白，进行ｃＤＮＡ克隆，分析其生化和分子特性，探究其生理功能，寻找生物防治新靶标，为发展新型高效生物杀虫剂提供理论依据。

该项目以重要的农业害虫金龟子的幼虫（蛴螬）中肠围食膜为主要研究对象，分离鉴定中肠新靶标蛋白。构建了高质量的华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫中肠cDNA表达文库。应用抗体免疫筛选法及RACE技术，克隆了华北大黑鳃金龟围食膜几丁质结合蛋白编码基因hocbp2及hocbp76（GenBank登录号分别为JF681185、JF681186），其可译框架分别为1947bp和1725bp，编码蛋白的预测分子量分别为70.2kDa和62.3kDa，重组蛋白HoCBP2和HoCBP76都在大肠杆菌和昆虫细胞中进行了成功表达；几丁质结合实验表明HoCBP2和HoCBP76都具有几丁质结合能力；免疫定位研究发现几丁质结合蛋白HoCBP2和HoCBP76二者在华北大黑鳃金龟卵期围食膜形成时就存在，定位在中肠和围食膜上。分离鉴定了华北大黑鳃金龟几丁质酶基因hochi和丝氨酸羧肽酶基因hoscp（GenBank登录号分别为HM596340和JF681184），其可译框架分别为1458bp和1371bp，编码蛋白的预测分子量为分别为51.8kDa和51.2kDa，并分别在大肠杆菌和毕赤酵母中成功进行了表达；酶活分析实验显示了重组蛋白HoSCP的丝氨酸羧肽酶活性，2、3龄幼虫初期的中肠液羧肽酶活性高于幼虫蜕皮前羧肽酶活性。克隆了暗黑鳃金龟围食膜几丁质结合蛋白编码基因hpcbp45、几丁质脱乙酰酶基因hpp42、几丁质酶基因hpchi31和羧酸酯酶基因hpc19，其可译框架分别为1923bp、1107bp、1446bp及1605bp，编码蛋白的预测分子量分别为69.6Kda、42.2kDa、51.8kDa及59.0kDa，重组蛋白HpCBP45、HpP42、HpChi31在大肠杆菌中进行了成功表达。华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟围食膜新靶标蛋白及其它中肠蛋白的鉴定，在理论上填补了昆虫生理生化领域的空白，在实践上可为害虫生物防治提供新途径。