结直肠癌外泌体MFG-E8经由JAK-STAT通路调控MDSC活化的作用机制研究

Evasion of the immune response is considered as one of the hallmarks of cancer closely associated with metastasis. Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) play an essential role in immune evasion during tumor development. Exosomes are involved in the cross-talk between tumor cells and immune microenviroment. We have previously proved MFG-E8 as an oncogene in colorectal cancer promoting invasion and EMT of colorectal cancer cells. We further separated exosomes from HT-29 culture medium and western blotting detected high MFG-E8 levels. Using a fluorescence activated cell sorter, we acquired MDSCs from the peripheral blood of metastatic colorectal cancer patients. We found that treatment with HT-29 culture medium could promote the growth of MDSCs accompanied by upregulation of Arg-1 and iNOS mRNA expression and STAT3 phosphorylaytion while treatment with culture medium form MFG-E8 knockdown HT-29 cells didn’t have these effects. This is suggestive that MFG-E8 derived from exosomes of colorectal cancer may mediate the immunosuppressive function of MDSCs via JAK-STAT pathway. In this study, we aims to clarify that MFG-E8 on exosomes derived from colorectal cancer cells can active MDSCs via JAK-STAT pathway and further reveal the underlying molecular mechanism in vitro as well as in vivo.

免疫逃逸是恶性肿瘤的典型特征，与肿瘤转移密切相关，肿瘤免疫微环境中的髓源性抑制细胞（MDSC）在其中起了关键作用。外泌体在肿瘤细胞与肿瘤免疫微环境的交互对话中承担了重要角色。我们前期在证实了MFG-E8促进结直肠癌转移的基础上，分离了结直肠癌细胞HT-29培养上清中的外泌体，发现存在MFG-E8表达。通过流式分选我们获得了转移性结直肠癌患者外周血MDSC，应用HT-29上清刺激后发现能促进其增殖，并诱导Arg-1和iNOS转录水平上调及STAT3磷酸化。而MFG-E8沉默的HT-29上清上述效应显著减弱。这提示我们结直肠癌来源的MFG-E8可能通过外泌体途径激活JAK-STAT通路进而诱导MDSC活化。本项目拟从细胞、分子、动物三个水平研究结直肠癌外泌体MFG-E8经由JAK-STAT通路促进MDSC活化的功能及分子机制，明确MFG-E8诱导肿瘤细胞免疫逃逸在结直肠癌转移中的作用。

免疫逃逸是恶性肿瘤的典型特征，与肿瘤转移密切相关，肿瘤免疫微环境中的髓源性抑制细胞（MDSC）在其中起了关键作用。外泌体在肿瘤细胞与肿瘤免疫微环境的交互对话中承担了重要角色。本项目研究中，我们通过分离过表达MFG-E8的HT-29结直肠癌细胞外泌体，用于刺激转移性结直肠癌患者外周血分离所得MDSC后发现其增殖及活化因子表达水平均显著上调。另一方面过表达MFG-E8的HT-29来源外泌体刺激后的MDSC较之对照处理组能显著上调CD8+T细胞中IFN-γ的表达水平，并能促进CD8+T细胞的增殖。同时MFG-E8过表达HT-29细胞来源外泌体刺激结直肠癌患者外周血MDSC后能够显著上调其中STAT3，体外实验证实了STAT3或者JAK1敲减的MDSC分别给予MFG-E8过表达的HT-29细胞来源外泌体刺激前后增殖能力无显著差异。同时实时荧光定量PCR证实了STAT3或JAK1敲减的MDSC中外泌体刺激后Arg-1和iNOS水平上调不明显。将过表达MFG-E8的外泌体刺激后的STAT3/JAK1敲减的MDSC与CD8+ T细胞共同孵育预处理，发现预处理前后CD8+T细胞的增殖能力变化不显著。另一方面应用JAK-STAT通路选择性抑制剂JSI-124 预处理MDSC，细胞增殖实验证实了预处理后的MDSC在H-29细胞来源外泌体刺激后增殖能力变化不显著。实时荧光定量PCR证实了经过JSI-124处理的MDSC经不同外泌体刺激后其Arg-1和iNOS水平差异不显著。 此外，将JSI-124预处理的MDSC与CD8+T细胞共同孵育，发现CD8+T细胞的增殖能力变化不显著。.综上所述，通过体外实验我们证实了MFG-E8在结直肠癌外泌体中高表达，并且通过外泌体途径作用于MDSC，诱导其增殖及活化。同时证实了结直肠癌外泌体MFG-E8对MDSC的调节作用依赖于JAK-STAT通路的活化。我们的研究揭示了结直肠癌免疫逃逸过程中的新的细胞分子机制，首次证实了MFG-E8通过外泌体途径调控肿瘤免疫抑制细胞MDSC的增殖及活化，进而营造了适宜肿瘤进展的微环境，而该调控过程是依赖于JAK-STAT通路的激活。