重组酵母菌生物合成醌类物质的代谢通路研究

The quinonoids-producing recombinant yeast has been authorized by the Chinese invention patent license, and the different gene expression and proteomics of the recombinant yeast were studied in our previous research. In order to understand the metabolism and regulation of biosynthesis pathways of quinonoids in recombinant yeasts deeply and comprehensive, we select quinonoids-producing recombinant yeast strain N5005 and N6076 as targets, and the metabonomics method based on ultra-performance liquid-chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS), ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) and high resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance (HR-MAS-NMR) will be applied to analyze the types and structures of quinonoids in recombinant yeast at different growth phases so that the distinct chemical characters can be obtained during growth phases in biosynthesis. Meanwhile, RNA-Seq method can be used to investigate gene expression in different growth phases in recombinant yeast. Sequentially, the metabolic pathways and molecular information of quinonoids biosynthesis can be obtained by using bioinformatics methods to carry on the system analysis of metabonome and transcriptome data. The biosynthetic pathways of two kinds of quinonoids will be verified by gene knockout/genetic complementation, gene over-expression strategy and metabonomics method. This project will provide feasible ideas and methods for exploring and developing biotechnical drugs and relating resources.

前期已对获得国家发明专利授权的产醌类物质的重组酵母菌进行了差异基因表达和蛋白质组学研究，为了从全局角度深入理解重组酵母菌生物合成醌类物质的代谢与调控机制，本项目以产醌类物质重组酵母菌N5005和N6076为研究材料，利用基于超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)、超高液相色谱和飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)和高分辨魔角旋转核磁共振(HR-MAS-NMR)的代谢组学方法，解析重组酵母菌不同生长阶段合成醌类物质的种类和结构；同时应用RNA-Seq方法，获得重组酵母菌相应生长阶段的转录组学信息；进而利用生物信息学方法对代谢组学和转录组学数据进行系统分析，获得重组酵母菌合成醌类物质的代谢通路的分子信息，解析其生物合成途径。利用基因敲除/遗传互补和基因过表达策略，对2种醌类物质的生物合成途径进行验证。本项目的研究将为生物技术药物的研发及其资源拓展提供可行的思路和方法。

前期通过低能离子注入介导药用植物甘草基因组DNA在酵母菌中的随机转化，获得了遗传稳定的产红色醌类化合物的重组酵母菌。为了深入理解醌类物质的代谢与调控机制，本研究综合运用基因组学、转录组学、代谢组学和生物信息学方法，开展了重组酵母菌的代谢通路研究。..基因组学研究结果表明，重组酵母菌基因组Contig数目比原始菌株增加了2条，基因数目增加了270个，重复序列和非编码RNA、碱基SNP和In/Del、基因组功能和基因GO功能均发生了明显变异。..差异表达基因的GO功能研究结果显示，重组菌株新增了14个生物学过程功能、2个细胞组分功能和2个分子功能，涉及1140个差异表达基因（DEGs）。差异表达基因的KEGG代谢研究结果显示，重组菌株新增了13 条代谢途径，涉及77个DEGs。萜类骨架生物合成(KEGG ID：ko00900)是其新增的一条重要代谢途径，为其萜类和醌类等次生代谢产物的生物合成提供了基本的C骨架，该代谢途径涉及5个DEGs。..差异代谢物研究结果表明，甲羟戊酸-5-磷酸(MVAP)是重组酵母菌胞内差异倍数最大的代谢物。MVAP为甲羟戊酸途径（MVP）的重要中间产物，是合成类异戊二烯、萜类和醌类物质的前体。重组菌株中MVP活跃，有利于次生代谢产物的生物合成。通过发酵过程中甲羟戊酸代谢量和甲羟戊酸激酶基因表达量的定量分析，验证了转录组学获得的DEG的表达量与其调控的代谢物的合成速率与代谢组学方法测得的相应代谢物产量的变化趋势的一致性。..通过次级代谢产物合成的基因簇的研究，获得了3个调控重组酵母菌次生代谢产物合成的基因簇及其分子信息，其中1个位于第12条染色体，2个位于第7条染色体，分别调控其萜类、内酯类和非核糖体肽类的生物合成。..通过QTOF、NMR、KEGG和antiSMASH，确定了重组酵母菌次生代谢产物中红色醌类化合物主成分的基本结构和化学组成及其代谢通路和生物合成途径。..本研究结果为进一步开展重组酵母菌的定向育种和代谢产物功能研究奠定了基础，对人们深入理解低能离子注入获得的重组酵母菌的次生代谢种类的多样性、复杂性及其调控机制具有一定的科学意义。