热休克蛋白90(Hsp90)调控猪圆环病毒2型复制的分子机制

Porcine circovirus type 2 (PCV2) is one of the most important swine infectious diseases, which has spread worldwide. But its pathogenic mechanism remains poorly understood. Heat shock proteins (HSPs) are a group of highly conserved cellular proteins, which play important roles in cell growth and differentiation, gene transcription, protein synthesis, folding and degradation. Recently, Hsp90 was found to be an important host factor for the replication of some viruses. Our previous results showed that Hsp90 upregulated in PCV2 infected PAMs and PK-15 cells. In this study, we will detect the effect of inhibition of Hsp90 on PCV2 replication. The roles of Hsp90α or Hsp90β in PCV2 replication will be tested after down-regulation of Hsp90α/β via RNA interference and up-regulation of Hsp90α/β via transfection of recombinant plasmids. The interaction of Hsp90α/β with viral ORFs will be identified by confocal microscopy and Co-IP. Furthermore, the signal pathways of Hsp90 client proteins, NF-κB pathway and ubiquitin-proteasome system will be examined, respectively. These results will be helpful for understanding the mechanism of replication and pathogenesis of PCV2 and development of novel antiviral therapies in the future.

猪圆环病毒2型（PCV2）是一种严重危害猪体健康，对养猪业具有重要影响的病原，但其致病机制尚不十分清楚。热休克蛋白（HSPs）是一类高度保守的蛋白质，在细胞生长分化、基因转录、蛋白质合成-折叠-分解等方面发挥重要生理作用。调节Hsp90表达能够影响多种病毒在宿主细胞中的复制能力。我们前期研究发现，PCV2感染的PAMs和PK-15细胞中Hsp90表达水平明显升高。本研究拟通过Hsp90抑制剂处理细胞，利用真核质粒过表达和靶基因siRNA干扰技术调节细胞内Hsp90表达量，观察PCV2复制水平变化，明确Hsp90α/Hsp90β对PCV2复制的影响及其与PCV2 ORFs的相互作用关系；同时检测调节Hsp90表达影响PCV2复制的信号通路分子变化，包括Hsp90客户蛋白、NF-κB通路和蛋白酶体途径，探明Hsp90调控PCV2复制的分子机制，有利于阐明PCV2致病机制和提供新的防控策略。

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是一种严重危害猪体健康，对养猪业具有重要影响的病原，但其致病机制尚不十分清楚。热休克蛋白（HSPs）是一类高度保守的蛋白质，在细胞生长分化、基因转录、蛋白质合成-折叠-分解等方面发挥重要生理作用。调节Hsp90表达能够影响多种病毒在宿主细胞中的复制能力。. 本研究首先使用Hsp90特异性抑制剂处理PCV2感染的宿主细胞（PK-15和3D4/31细胞），通过间接免疫荧光实验（IFA）、Western blot和TCID50等方法检测病毒含量，发现抑制剂处理后能够显著降低PCV2 Cap蛋白表达水平，设计合成siRNA转染宿主细胞，干扰细胞内源性Hsp90α和Hsp90β表达，同样能降低Cap蛋白表达水平；而构建真核表达质粒在细胞内瞬时过表达Hsp90α或Hsp90β均能促使Cap蛋白表达水平提高。激光共聚焦显示在这一过程中Hsp90β与病毒Rep和Cap蛋白存在共定位现象，Co-IP结果表明相关蛋白没有直接相互作用；以上实验结果说明Hsp90对PCV2的感染是必不可少的，并且能够促进病毒复制。进一步探究其中的信号通路机制，运用Western blot检测发现在Hsp90抑制剂影响病毒复制过程中，NF-κB中的分子活性受到了抑制，Hsp90的clinet protein（TBK1和p-Akt）的表达水平降低，而蛋白酶体途径没有参与降解病毒蛋白从而抑制病毒复制。另一方面，研究了Hsp90抑制剂在小鼠体内对PCV2复制的影响，给BALB/c小鼠腹腔注射Hsp90抑制剂，再接种PCV2，14天后处理小鼠收取样品，定量PCR检测发现抑制剂实验组小鼠血清、脾脏、肺脏、淋巴结组织样品中PCV2含量显著低于对照组，脾脏组织的免疫组化分析也显示实验组的PCV2抗原含量明显少于对照组，ELISA方法检测了小鼠血清中部分细胞因子水平，发现实验组小鼠TNF-α，IL-10水平显著低于对照组，而IL-1β的含量两组之间无差异。. 本研究揭示了细胞伴侣分子Hsp90在PCV2复制过程中的重要作用，指出Hsp90抑制剂能够有效降低PCV2在PK-15和3D4/31细胞、以及BALB/c小鼠体内的复制水平，对阐明该病毒致病机制、研究新型抗病毒药物和免疫调节剂具有重要理论意义。