缺氧诱导因子-1α调控恶性黑色素瘤细胞中CD147表达的机制研究

缺氧刺激可以影响肿瘤细胞的信号转导通路及其生物学行为。在前期工作中，我们证明CD147在恶性黑色素瘤细胞的侵袭转移和糖酵解过程中发挥重要作用并发现缺氧条件下CD147可能受HIF-1α的调控。本项目拟首先通过生物信息学分析、荧光素酶活性分析和超凝胶迁移试验进一步证实HIF-1α确实能结合到CD147的启动子区域并找到其结合位点；然后过表达或siRNA干扰HIF-1α,在常氧或缺氧条件下培养恶性黑色素瘤细胞株，real-time PCR和Western blotting分析CD147表达的变化情况；最后，收集临床诊断明确的恶性黑色素瘤病理组织标本，运用免疫组织化学方法同时检测HIF-1α、CD147的蛋白表达水平和相对位置情况并进行两者相关性分析，初步揭示HIF-1α调控CD147的临床意义。本项目的完成，将明确HIF-1α在恶性黑色素瘤缺氧微环境中调控CD147的具体作用机制。

本项目的研究内容圆满完成。（1）我们研究发现缺氧可诱导CD147的mRNA和蛋白水平表达的升高。物理缺氧（1%氧浓度）培养条件下，A375∕G361细胞培养24h后用流式细胞仪检测CD147蛋白，发现明显升高；用Cocl2模拟化学缺氧培养条件下，A375∕G361细胞中CD147的mRNA和蛋白表达均呈现出剂量依赖和时间依赖的特点。（2）我们的研究发现HIF1α介导了缺氧诱导的CD147表达增高。siRNA干扰抑制HIF1α的表达后，A375∕G361细胞化学缺氧培养条件下所诱导的CD147增高被明显抑制；而外源性的HIF1α表达增高和化学缺氧可协同诱导黑素瘤细胞中CD147的增高。（3）通过生物信息学分析和启动子基因片段缺失分析，我们鉴定了CD147启动子﹣48bp位置的保守系列ACGTG为潜在的HIF1α转录结合位点，并用ChIP实验方法证实了HIF1α和CD147的确能二者结合在一起，而点突变该位点可以阻断二者的结合。（4）我们用体外实验检测发现了siRNA干扰抑制CD147表达后可以部分阻断A375∕G361细胞缺氧诱导的MMP2激活。并进一步做裸鼠动物实验在体内验证了这一现象。（5）我们细胞生物学实验研究发现干扰抑制CD147表达后缺氧和常氧条件下培养的A375肿瘤细胞的侵袭能力明显下降。（6）我们免疫组化实验还发现在恶性黑素瘤病人的临床标本中CD147和HIF1α蛋白的共表达，且二者相关性分析结果为正相关。进一步分析CD147和HIF1α的表达水平与肿瘤远处转移的临床相关性，发现了肿瘤转移与CD147相关而与HIF1α不相关。