增香型乳酸菌的构建与其对青贮饲料品质优化的研究

The project aims to construct a functional lactic acid bacterium for silage using genetic engineering, metabolic engineering technology and other means. Leymus secalinus is suitable for cultivation in the desert grassland grass. It has properties of high yield, good tolerance, high wintering rate; silage can improve the palatability of Leymus secalinus. Dehydrodimers of hydroxycinnamic acids, such as ferulic acid, are important structural components which serve to cross-link polymers in plant cell walls. Such cross-links hinder cell wall degradation by ruminant microbes. Feruloyl esterases are a subclass of the carboxylic acid esterases that hydrolyze the ester bond between hydroxycinnamic acids and sugars present in plant cell walls in treated silage. In this project, the pathway of ferulic acid to vanillin was introduced into the lactic acid bacteria by screening of the strain, codon optimization and the expression changes of proteins. In the process of silage, ferulic acid was transformed into vanillin to improve the palatability of Leymus secalinus silage, with aroma regulation and antibacterial function by using aroma-type lactic acid bacteria. At the same time, the nutrient preservation and microbial flora are also investigated, to reveal the role of vanillin and lactic acid bacteria in raising silage quality. The construction of such functional lactic acid bacteria will provide technical support and theoretical basis for the efficient use of forage and the development of new silage additives.

本项目旨在利用基因工程、代谢工程技术等手段，为牧草青贮构建增香型乳酸菌添加剂。赖草是适合在荒漠草原种植的牧草，具有产量高、耐受性好和越冬率高等特点，青贮能提高赖草的适口性。阿魏酸是一种酚酸，在植物中主要与细胞壁多糖和木质素交联构成细胞壁的一部分，青贮过程中在阿魏酸酯酶的作用下被释放出来。本项目通过菌种筛选、优化编码基因和调节蛋白表达水平，在乳酸菌中引入香草醛的合成途径，获得增香型乳酸菌。在青贮过程中，利用增香型乳酸菌将阿魏酸转化为具有香味调节和抗菌功能的香草醛，以提高赖草青贮的适口性，同时研究在青贮过程中营养物质保存情况和微生物菌群变化情况，揭示香草醛及乳酸菌在牧草青贮中提升青贮饲料品质的作用机理。增香型乳酸菌是从自然界无法筛选到的，构建这样的功能型乳酸菌将为牧草的高效利用与新型青贮添加剂的开发提供技术支持和理论基础。

本项目旨在利用基因工程、代谢工程技术等手段，为牧草青贮构建增香型乳酸菌添加剂。项目根据研究内容，设计了耐受菌株筛选、纤维降解乳酸菌的筛选与构建、增香乳酸菌构建、青贮饲料宏基因组分析等工作。部分成果和发现为国际首创成果，项目在国际上率先对青贮饲料的宏基因组进行了深入分析，首次在青贮饲料中发现了病毒及古菌，研究团队筛选的短乳杆菌可以降低病毒含量20%以上，降低抗性基因种类10%以上。发现蛋白质细菌在青贮饲料中的丰度<10%，是青贮饲料中第二丰富的菌门，是抗性基因的主要来源。对青贮过程的病深入研究开创了新方向；在国际上首次将乳酸菌的抑菌物质耐受性及乳酸菌产生的抑菌物质作为筛选标准。根据香草醛的结构，项目研究选择了乳酸菌内源抑菌物质苯乳酸作为筛选物，在平板上初步进行苯乳酸及香草醛耐受菌株后在液体培养中进行验证，发现耐受较高浓度苯乳酸的乳酸菌也具有较好的香草醛耐受性，且其生产苯乳酸的浓度也较高。苯乳酸高耐菌株作为苜蓿青贮饲料添加剂时，苯乳酸产量高，氨态氮含量低，说明除了乳酸和乙酸外，乳酸菌产生的PLA对苜蓿青贮饲料的品质也有重要影响。研究明确了抑菌物质对青贮的作用，为青贮添加剂的筛选及评价提供了新方法；创新性建立了最简洁纤维降解乳酸菌并分析了阿魏酸酯酶酶活高低对降解产物的影响。几株阿魏酸酯酶生产菌株均未显著提高高粱青贮饲料的消化率。植物乳杆菌在30℃时阿魏酸提取率较高，而发酵乳杆菌在40℃时阿魏酸提取率较高。阿魏酸酯酶生产菌株可以部分改善高温的负面影响。项目构建了能够分泌两个多功能糖苷酶的乳酸菌，在20℃、30℃和40℃条件下，使苜蓿青贮饲料的水溶性碳水化合物含量分别比对照提高72%、55%和155%。半纤维素、纤维素和酸性洗涤剂木质素含量分别比对照降低17%、6%和14%。筛选出的阿魏酸酯酶产生菌和纤维降解菌促进了青贮过程阿魏酸解离，可以作为香草醛产生作为基础。构建的香草醛转化菌株香草醛产量可达20g/L。研究为提升青贮饲料品质提供了新技术。