低温保存中冰晶对细胞和生物组织力学损伤微观机理的实验研究

Direct cell injury in cryobiology is highly dependent on intracellular ice formation during cell and tissue freezing. Study of the intracellular ice formation and the thermo-phase change coupling mechanical behavior are essential to the mechanistic understanding of cellular damage during cryopreservation. The freezing experiments of cell and biological tissue are carried out employing both the high-speed micro-digital photography in situ measurement and the cryofixation SEM observation to study the intracellular ice growth in the process of freezing cells and biological tissues. The dynamic deformation characteristics and damage behaviors of intracellular microstructure caused by thermo-phase change coupling interaction are also studied. Then, the micromechanism of mechanical injury of cell and biological tissue is investigated. With a high-speed cryomicroscopy system and a cryofixation SEM, the intracellular ice nucleation site, growing direction, growth rate, morphology change, and phase change interface transfer characteristic are explored. Based on the experimental observations, the relationship among intracellular ice formation, cooling rate, intracellular microstructure, and the morphology change and dynamic deformation of cell and tissue are discussed and analyzed on micro- and nanoscale. The internal stress due to the volumetric expansion (induced phase change during intracellular ice formation) and the thermal stress due to the temperature change during freezing are studied. At last, the micromechanism of the crack formation and growth of cell and tissue during freezing is revealed, which is helpful to preserve the cell and biological tissue.

低温造成的直接细胞损伤与冷冻中形成的胞内冰晶有密切关系，理解胞内冰晶形成与生长机制及温变-相变耦合所诱发的力学行为，对细胞和组织的成功保存有着重要的意义。基于细胞和生物组织低温冷冻实验，应用高速低温显微成像原位观测和冷冻固定电镜观察相结合的研究方法，研究细胞和生物组织在低温冷冻过程中胞内冰晶形成、生长及温变-相变耦合作用所诱发的内部微观结构动态变形和破坏行为，探索其在低温保存中冷冻损伤的微观机理。观测胞内冰晶成核、生长方向、生长速率和形态变化等瞬态特征，以及冷冻相变界面形态演化趋势。探究胞内冰晶形成、生长与降温速率、胞内微观结构的关系，分析细胞和生物组织微纳尺度形态尺寸变化和动态变形特征。研究冰晶生长过程中相变所引起体积膨胀而产生的内应力，以及冷冻过程中温变所引起的热应力进而揭示冻结过程中微观裂纹成核、生长以及断裂的微观机理。研究结果可为细胞和组织的低温保存提供理论。

生物材料的低温保存、食品和果蔬冷冻贮藏等低温冷冻加工操作均将细胞或者整个组织降低到零下温度，以降低新陈代谢速度，达到保存或保鲜的目的。而低温损伤的程度直接决定了细胞与生物体的存活与否以及食品的贮藏保鲜状态。目前，虽然低温生物保存技术已经广泛应用于医学和食品工程等领域，但是对于低温所带来的生物体损伤的机理并不完全清楚。本项目从探索细胞和生物组织低温损伤微观机理出发，针对冰晶生长与低温造成的直接细胞损伤关系，温度变化、凝固相变及界面迁移、胞内环境各向异性等对细胞力学性能及材料破坏行为的影响关系进行了一系列研究。. 本研究项目的结果包括四方面内容：（1）对洋葱内表皮细胞冰晶生长及存活进行观测研究，发现细胞在降温过程中发生“flashing”，即“瞬间冻结”现象。从微纳尺度上对冰晶的成核位置、生长取向及形貌、持续时间以及团簇式冻结过程进行了观测，为进一步分析低温冷冻条件下胞内冰晶生长机制与生物组织形态尺寸变化及动态变形特征的关系奠定了基础。（2）提出了利用灰度检测细胞冰晶生长的测试方法，并对人胚肾上皮细胞（293T）进行了冷冻实验，发现不是所有的细胞都产生胞内冰晶，得到了胞内冰和胞外冰的萌生及扩展关系。运用数字图像相关方法获得了细胞全场位移随温度加载的变化，同时建立了冷冻速率与细胞瞬间冻结温度的关联性。以上微尺度上冰晶成核、演化及其对组织结构影响的确定为研究低温冷冻过程中微裂纹成核、生长以及破裂行为奠定了基础。（3）通过对马铃薯组织在不同低温下的拉伸测试数据进行分析，得到了生物组织不同取向下的应力-应变关系，分析了降温速率、冷冻温度、保持时间对生物组织弹性模量、抗拉强度、相变温度等力学性能和热物性能的影响。（4）结合对典型细胞和生物组织冰晶生长演化的研究结果，研究了温变-相变耦合诱发的细胞组织变形和损伤，揭示了低温保存过程中生物材料微观裂纹成核、生长以及断裂的微观机理。