禾谷镰刀菌中翻转酶FgDnfA和FgDnfB在致病过程中的作用机制研究

Fusarium head blight caused by F. graminearum poses a great challenge to grain production and food security. The biosynthesis and exportation of extracellular enzymes and mycotoxin DON, the important virulence factors for F. graminearum, have close relationships with membrane traffic. In Saccharomyces cerevisiae, flippases play important roles in regulation of membrane traffic. Previously, we identified five flippases encoded by five different genes in F. graminearum, and subsequently deleted all the five genes successfully. We proceeded to assess the phenotypes of the deletion mutants and wild-type strain. Corresponding findings from these assays showed that FgDnfA and FgDnfB in flippase family played critical roles in vegetable growth and virulence in F. graminearum. Based on these preliminary results, this project aims at further exploring detail biological functions and operational mechanisms of FgDnfA and FgDnfB from the following aspects. Firstly, we will construct genes complemented strains and double-genes deletion mutants to clarify the biological functions of FgDnfA and FgDnfB in growth, development, secondary metabolism and pathogenesis of F. graminearum. Secondly, we will combine cytological and proteomic analysis to explore the regulation mechanisms of FgDnfA and FgDnfB in membrane traffic and the biosynthesis and exportation of DON，try to explain the mechanisms of virulence in F. graminearum from a new point. Results of this project will supply essential information to the research of membrane system and secondary metabolism in other filamentous fungi.

由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病严重威胁粮食生产和食品安全。胞外水解酶和DON毒素是其重要的致病因子，而它们的合成和外泌过程均与膜运输系统密切相关。酿酒酵母中的研究发现，翻转酶在膜运输系统的调控中发挥着重要的作用。前期，我们已在禾谷镰刀菌中鉴定到5个分别编码翻转酶的基因并成功敲除；通过初步表型分析，我们发现在翻转酶家族中，FgDnfA和FgDnfB在菌体的营养生长和致病过程中发挥着重要的作用。因此，本项目拟对翻转酶FgDnfA和FgDnfB的生物学功能及作用机制展开深入的研究，包括以下两方面：⑴通过基因回补和双敲除及表型分析，阐明FgDnfA/B在禾谷镰刀菌生长、发育、次生代谢和致病过程中的生物学功能；⑵通过细胞学观察和蛋白质组学分析，阐明FgDnfA/B在膜运输及DON合成与外泌过程中的功能而从新角度阐述禾谷镰刀菌的致病机制。预期研究成果将为其它丝状真菌中膜系统和次生代谢的研究提供重要参考。

由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病严重威胁粮食生产和食品安全。胞外水解酶和DON毒素是其重要的致病因子，而它们的合成和外泌过程均与膜运输系统密切相关。酿酒酵母中的研究发现，翻转酶在膜运输系统的调控中发挥着重要的作用。因此，本项目拟对翻转酶在禾谷镰刀菌致病过程中的生物学功能及作用机制展开深入的研究。主要研究内容包括以下3点：1、基因敲除及互补实验研究翻转酶家族中5个翻转酶的生物学功能； 2、细胞学观察及生化分析研究5个翻转酶在膜运输过程中的功能和作用模式；3、通过细胞学观察和基因表达分析研究DON合成过程中翻转酶的功能和作用模式。研究结果表明：1、在禾谷镰刀菌的5个翻转酶中，FgDnfA/B/D在营养生长、繁殖和致病过程中发挥着重要的调控作用，且3个基因之间存在功能冗余的现象；2、在5个翻转酶中，只有FgDnfA的缺失会影响蛋白的外秘过程，说明FgDnfA对蛋白外泌非常重要，但5个翻转酶的分别缺失并不影响菌体的内吞过程；3、FgDnfA和FgDnfD的缺失导致DON产量显著下降，其可能通过正调控TRI基因而参与DON毒素的合成过程，另外FgDnfA的缺失导致在DON合成诱导情况下，DON合成关键基因Tri1在细胞中不能正确定位，表明FgDnfA对于DON的合成非常重要；而FgDnfB可能通过负调控TRI基因的表达而负调控DON毒素的合成过程。以上结果表明，翻转酶FgDnfA/B/D在禾谷镰刀菌生长发育，致病过程和次生代谢中发挥着重要的作用。本研究为深入分析禾谷镰刀菌DON毒素的合成机制提供新的线索，同时为其它物种中翻转酶的研究提供参考。