基于蛹虫草钟蛋白CmFRQ泛素化降解而影响子实体形成的机理研究

The clock gene Cmfrq from Cordyceps militaris was cloned by RT-PCR. According to the putative amino acids sequence of clock protein CmFRQ, two methods were used to prepare CmFRQ-antibodies: 1) the antigenic determinant short peptides was chemically synthesized and coupled to protein carriers, and then used to prepare antibodies; 2) partial CmFRQ fragment was expressed by Escherichia coli and used to prepare antibodies. The prepared antibodies were used to detect CmFRQ in C. militaris by Western blotting analysis. According to the biological information analysis of CmFRQ ubiquitination sites, it was designed the corresponding nucleic acid sequence mutation of Cmfrq gene, and analysed the affection of CmFRQ ubiquitination sites mutations on the fruiting body formation of C militaris by Western blotting. Using ubiquitin proteasome inhibitors blocking CmFRQ ubiquitin degradation in C militaris, the form of CmFRQ was analysed by the Western blotting, and the effect of CmFRQ ubiquitination degradation on the fruiting body formation of C militaris was determined. Combining with the real-time PCR analysis of expression level of mitogen-activated protein kinase (MAPK) and protein kinase A (PKA) in the mycelia or/and fruiting body of C militaris, it was synthetically analysed the effect of CmFRQ ubiquitination degradation on the fruiting body formation of C militaris.

采用RT-PCR从蛹虫草（Cordyceps militaris）中克隆钟基因Cmfrq。设计两种方法制备抗体，其一是化学合成CmFRQ抗原决定簇短肽，偶联载体蛋白后作为抗原制备抗体；其二是通过原核表达Cmfrq基因的部分序列获得融合表达蛋白，以此融合蛋白作为抗原制备抗体。利用制备的抗体进行Western blotting分析，检测蛹虫草中CmFRQ的表达。生物信息学分析CmFRQ的泛素化位点，设计Cmfrq相应核酸序列突变，Western杂交分析CmFRQ的突变对蛹虫草子实体形成的影响。利用泛素蛋白酶体抑制剂对蛹虫草CmFRQ泛素化降解的阻断作用，Western杂交分析CmFRQ的存在形式，确定CmFRQ泛素化降解对子实体形成的影响。结合Real-time PCR分析钟蛋白CmFRQ泛素化位点突变株的MAPK和PKA的表达，综合分析蛹虫草CmFRQ泛素化降解对蛹虫草子实体形成的影响。

生物钟普遍存在于真核细胞生物中，根据真菌中的模式真菌粗糙脉孢菌的研究结果表明，与生物钟相关的基因包括frq（frequency）、wc-1（white colar-1）和wc-2等。本研究中主要研究了蛹虫草（Cordyceps militaris）中的生物钟基因Cmfrq，以及相关的Cmwc-1和Cmwc-2。本研究主要包括：（1）采用LC-MS /MS结合高度敏感的免疫亲和纯化技术，综合分析了黑暗和蓝光条件下蛹虫草菌丝体和子实体中蛋白质中赖氨酸的泛素化过程。共鉴定出538个赖氨酸泛素化蛋白，其中包括934个赖氨酸泛素化肽的981个泛素化位点。分析了黑暗和蓝光条件下蛹虫草从菌丝到子实体的发育过程中的生理生化变化。（2）采用蓝光和蛋白酶体抑制剂MG132处理蛹虫草，观察蛹虫草菌落、菌丝体和子实体形态的变化。结果表明蓝光和MG132都可以导致蛹虫草菌落、菌丝形态和子实体形态发生变化，直观表明MG132在蛹虫草中是一个很好的蛋白酶体抑制剂。（3）以不同时间的蓝光照射和蛋白酶体抑制剂MG132处理蛹虫草菌丝体，通过实时荧光PCR分析了Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2转录水平变化，确定了蛹虫草中这三个基因的相互关系以及MG132对这三个基因表达的影响。（4）通过重叠延伸的方法构建了CmFRQ中可能的氨基酸泛素化位点的突变，并采用同源重组的方法转化蛹虫草后，末获得突变菌株，但获得了Cmfrq-DNA干扰蛹虫草分生孢子中Cmfrq-mRNA的菌株454，该菌株表现为去退化现象。（5）以菌株454为研究对象，进行6代转接以后，分析了每代蛹虫草菌丝体中CmFRQ的表达，确定蛹虫草子实体的退化与CmFRQ的降解有关。（6）构建了转化蛹虫草进行基因编辑的cas9蛹虫草表达载体，并进行了蛹虫草的转化研究；（7）原核表达获得了有活性的cas9蛋白，并与sgRNA共同电击转化蛹虫草原生质体，获得了一个CmFRQ点突变株。通过该研究已经获得了预期的研究结果，相关研究仍然还在完善中。