p53异构体泛素化的调节机制

Ubiquitination is involved in essentially all of the intracellular processes in eukaryotes. As one of the most important tumour suppressors, p53 stability and activity is tightly regulated by its ubiquitination. The discovery of various p53 isoforms reveals more complicated mechanisms of how p53 suppresses tumours. However, the regulation of p53 isoforms has been properly studies. Thus, this project aims to investigate the ubiquitination of p53 isoforms, and discover the enzymes involved. Moreover, the impact of ubiquitination on the stability and activity of the p53 isoforms will be analysed. The effects of ubiquitination of p53 isoforms in regulating wild-type p53 functions will also be inspected. Finally, this study will provide useful information on the development of inhibitors/enhancers targeting the pathway of p53 isforms ubiquitination. Eventually the application of the inhibitors/enhancers will increase the sensitivity of tumours in response to radiotherapy.

泛素化广泛参与细胞内各项生理活动。p53作为最重要的抑癌因子之一，其蛋白稳定性和活性受到泛素化的严格调控。随着p53异构体的被发现，它们在肿瘤产生中的作用也在慢慢被揭示，而对它们自身调控的研究却几乎是空白。因此，本课题通过对p53异构体泛素化的研究，找出参与泛素化的因子，探索它们自身稳定性及活性调节的机制，进一步了解它们和野生型p53的相互调控和影响。同时，为研究开发异构体泛素化调节剂提供理论依据，最终达到提高肿瘤放射治疗增敏的效果。

抑癌基因p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因之一，约50%的肿瘤中存在p53突变，余下的肿瘤中，p53信号通路受阻。p53在调节细胞生长周期、DNA修复、细胞衰老或者诱导细胞程序性死亡（凋亡）等方面起着重要作用。通过不同的转录翻译起始位点和RNA选择性剪接，p53基因一共可以编码至少12个异构体。临床数据表明，p53异构体在多种肿瘤中表达异常。目前的研究主要集中N端的异构体上，对于p53 C端异构体的研究很少，p53β或p53γ的独特生物活性也未见报道，仅有一篇文献发现p53β可以增强p53缺失型细胞对化疗药物的敏感性。. 我们首先确定了以p53β为主要研究对象。前期实验发现，p53β可以抑制p53缺失型肿瘤细胞生长，X射线可以上调p53β表达。但瞬时表达p53β需高度依赖转染效率。制备稳定表达细胞株时，作为对照，需要同时建立p53的稳定表达细胞株。但是p53持续高表达对于细胞有很大的抑制增殖、促进凋亡的作用，难以获得稳定表达细胞株。所以，我们引进Tet-On诱导表达系统（Clontech），建立诱导表达细胞株。通过调节细胞中p53β的表达水平，采用CCK8法、克隆形成实验、流式细胞仪等方法检测其对细胞增殖、存活、周期等的影响，并用western blotting方法加以验证，以研究p53β的生物学效应。同时，利用诱导表达细胞，研究p53β泛素化的过程和机制，筛选相关的泛素连接酶E3和去泛素化酶。. 经过研究，我们发现了：.1. p53β可以抑制p53缺失型肿瘤细胞生长；.2. X射线可以上调p53β表达；.3. p53α和p53β的重新克隆；.4. p53β表达抑制细胞生长；.5. p53β表达促进细胞凋亡；.6. p53β表达不影响细胞周期。. 以上结果很好的揭示了p53β的对于细胞的作用效应，并且提示了与野生型p53不同的作用机理，为接下来的机制研究打下良好的基础；同时，诱导表达系统具有背景低、诱导快速且效率高、毒性小、诱导可逆等优点，诱导表达细胞株的建立，为后续实验提供了强有力的工具。