TGFβ反式激活EGFR信号通路并促进乳腺癌细胞侵袭转移的分子机制研究

EGFR and TGFβ signal pathway are critical for cancer initiation and progression. Activation of EGFR signaling predominantly promotes tumorigenesis and development, whereas TGFβ acts a potent tumor suppressor and tumor enhancer in a context-dependent manner. Cross-talk between EGFR and TGFβ signaling pathway was observed in many types of tumors, and was correlated with cancer progression and resistance to EGFR-targeted drugs. However, the detailed mechanism remains unclear. Our previous study showed that TGFβ promotes migration and invasion of breast cancer cells along with elevated expression of EGFR protein and activation of EGFR downstream signaling, and knockdown of EGFR inhibits this promoting effect of TGFβ. In addition, two Smad3 and multiple SP1 binding sites were identified in the EGFR promoter region. We further found that TGFβ induced a significant enhancement of the binding capacity of SP1 to EGFR promoter. Moreover, the promoter activity of EGFR was also enhanced after TGFβ stimulation. These data suggest that TGFβ could transactivate EGFR signaling in breast cancer cells. In this study, we plan to use chromatin immunoprecipitation assay, luciferase reporter assay, immunofluorescence, Western blot, RNA interference methods and in vivo SCID mouse model to investigate the molecular mechanism through which TGFβ transactivates EGFR signaling, and to clarify the detailed role of EGFR in TGFβ-induced activation of canonical Smad and Non-Smad signaling.

EGFR和TGFβ信号通路与肿瘤发生发展关系密切。EGFR通路的活化促进肿瘤进展，而TGFβ在肿瘤发生发展过程中发挥双向调节的作用。这两个通路间存在交互作用，且这种交互作用能够促进肿瘤进展和靶向药物的耐药，但其分子机制尚不明确。前期研究发现TGFβ促进乳腺癌细胞迁移侵袭的同时，伴随着EGFR表达增加和下游通路的激活；而降低EGFR的表达则抑制TGFβ的作用。进一步发现EGFR的启动子区存在转录因子Smad3和SP1的结合位点，且TGFβ能够促进SP1与EGFR启动子区的结合，并增强启动子的活性，初步证实TGFβ可能反式激活EGFR信号通路。本研究拟采用染色质免疫共沉淀、荧光素酶报告基因实验、免疫荧光、Western blot、RNA干扰和乳腺癌转移小鼠模型等多种实验方法，阐明TGFβ反式激活EGFR信号通路的分子机制，明确EGFR在介导TGFβ激活经典Smad和非Smad信号通路中的作用。

EGFR和TGFβ信号通路与肿瘤发生发展关系密切，这两个通路间的交互作用促进肿瘤进展和治疗耐药，但机制尚不明确。本次研究发现：EGFR和TGFβ在乳腺浸润性导管癌组织中的表达呈显著正相关，而且TGFβ高表达组患者的总体生存率和无病生存率均明显下降；此外，EGFR和TGFβ同时高表达患者的总体生存率和无病生存率均显著低于二者低表达的患者。体内外研究证实，TGFβ能通过诱导EGFR表达上调而促进乳腺癌细胞在体外迁移和侵袭以及在小鼠体内的转移能力；而敲减EGFR的表达或采用小分子抑制剂封闭EGFR的活性则抑制了TGFβ的这种作用。机制研究发现，TGFβ对EGFR的上调并不通过调控EGFR的蛋白稳定性或其翻译，而主要通过在转录水平上调EGFR的mRNA实现的。染色质免疫共沉淀（CHiP）实验发现转录因子Smad3和SP1能够结合EGFR的启动子并增强其活性，而且这种结合作用能够被TGFβ所增强；荧光素酶报告基因实验证实SP1和Smad3能够增强EGFR的启动子活性，且TGFβ刺激能够进一步增强两个转录因子的活性。随后，采用定点突变技术分别突变EGFR启动子区SP1或Smad3的结合位点，结合荧光素酶报告基因实验分析发现，突变组的EGFR启动子活性显著受到抑制，进一步证实SP1和Smad3通过结合EGFR的启动子介导TGF-β上调乳腺癌细胞中EGFR的表达。接下来，分别采用小干扰RNA或小分子抑制剂等研究手段证实，抑制经典Smad信号通路的激活或者非典型ERK/SP1通路的激活能够均显著抑制EGFR的mRNA和蛋白表达水平，同时乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力也受到抑制，而且SP1的作用要强于Smad3。 此外，联合抑制上述两个通路能够更加显著抑制EGFR的表达和细胞的侵袭能力,不过SP1和Smad3对EGFR的调控并没有协同作用，而是一种叠加作用。总之，上述研究结果证实，TGFβ通过激活经典Smad3信号通路和非典型的ERK/SP1信号通路上调EGFR的启动子活性，促进EGFR的表达上调，并促进乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。我们的研究结果揭示了乳腺癌细胞中TGFβ反式激活EGFR的一种机制，同时这些结果也提示联合抑制EGFR和TGFβ信号通路可能成为一种治疗乳腺癌的手段。