HPV16E6/E7-PKR-GSK3beta假想轴及其下游分子群在宫颈癌发生发展中的作用及机制研究

Cervical cancer is a representative disease caused by the persistent human papillomavirus (HPV). We have reported earlier that inhibited function of PKR and GSK3β was found in cervical cancer. Preliminary exploration on this finding revealed that HPV pathogenesis can be partly explained by HPV16E6/E7 inhibition to the PKR-GSK3β pathway. The present study will further probe into the mechanism by conducting the following procedures. First, the interaction between PKR and GSK3β will be identified. Secondly, HPV16E6/E7 regulator genes and downstream target genes of PKR and GSK3β will be screened using Microarray, then the downstream molecules of HPV16E6/E7-PKR-GSK3β hypothetical axis will be verified using KEGG pathway database analysis. Third, the effects of these downstream molecules on the proliferation, apoptosis and invasion will be identified using molecular biology techniques. Last, these functions will be tested on large-sample clinical cases, and the mechanism of this axis and the significance of its downstream molecules as therapeutic targets in cervical cancer treatment will be explained on tissue, cellular, molecular and animal levels. In this way, the pathogenesis of HPV-induced cervical cancer mediated by HPV16E6/E7-PKR-GSK3β will be evaluated systemically from both in vitro and in vivo perspectives. Therefore the study will contribute to new and more precise therapeutic targets in HPV inflection diagnosis and treatment.

宫颈癌是持续病毒感染致癌的典型疾病之一，我们前期研究发现在宫颈癌发病中，具有重要抗病毒抗肿瘤作用的PKR、GSK3β功能均被抑制，且HPV16E6/E7抑制PKR-GSK3β通路可能是HPV致病机制之一。本项目将在上述工作基础上，首先通过质谱分析等明确PKR对GSK3β调控方式及中间分子；继而通过Microarray筛选HPV16E6/E7调节基因及其PKR和GSK3β下游靶基因，经KEGG信号通路分析确认HPV16E6/E7-PKR-GSK3β通路的下游分子；进而利用分子生物学技术确认下游分子对宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭等影响；并进行临床大样本验证，从组织、细胞、分子及动物水平阐明这一通路的作用机制及下游分子作为宫颈癌治疗靶点的意义。从而在体内、外水平系统评价HPV16E6/E7-PKR-GSK3β介导HPV感染导致宫颈癌的发生发展机制，并为HPV感染的诊治提供新的更为精确的治疗靶点。

本项目设计从组织、细胞、分子及动物水平阐明HPV16E6/E7-PKR-GSK3β假想轴的可能作用机制及下游分子对永生化宫颈癌细胞生物学行为的影响；从体内、体外水平系统评价假想轴介导宫颈癌发生发展的机制，探索这一通路下游关键分子作为宫颈癌治疗靶点的可行性。本项目将有助于完善HPV 感染导致宫颈癌发生发展的机制，进一步解释宫颈癌的病因，为宫颈癌治疗提供新的、更为精确的分子干预靶点。.我们首先检测分析了HPV16E6/E7-PKR-GSK3β 假想轴作用机制及假想轴下游关键分子，发现GSK3β与PKR蛋白之间没有直接相互作用但都受到HPV16E6、E7的调控，GSK3β与PKR在mRNA水平及蛋白表达方面都与E6、E7拷贝数一致，说明HPV16E6、E7与GSK3β及PKR之间可能存在调控关系；HPV16 E6/ E7还可以调控宫颈癌细胞的生长、增加宫颈癌细胞的迁移、侵袭；.其次在探讨HPV致病机制研究方面，鉴于我们前期对多种皮肤良恶性增生性皮损的检测发现HPV38是与皮肤鳞状细胞癌（SCC）发病最为密切的亚型；我们利用透射电镜观察和免疫组化的方法发现，HPV38+的SCC组织中自噬水平明显增高，提示细胞自噬可能在HPV所致非黑素皮肤肿瘤发病中起着重要的作用，HPV38可能通过调节细胞自噬发挥其致癌作用，我们探讨了在细胞水平HPV38对细胞自噬的影响，其作用的分子机制以及PKR、GSK3β是否参与了对自噬的调控。结果显示HPV38 E6/E7能够引起细胞增殖，减少细胞凋亡发生，可以改变细胞正常周期调控，使S期细胞数增多，并通过激活PKR/eIF2a通路提高细胞自噬；通过对皮肤鳞状细胞癌中HPV38致癌机制研究证实了HPV38E6、E7可以通过调控角质形成细胞的自噬来参与肿瘤的发生，.然后通过对一个中国回族疣状表皮发育（EV）不良家系的研究，发现了LCK为EV的新致病基因，揭示了T细胞免疫缺陷在EV相关的HPV易感中的重要作用，拓展了对EV发病机制的理解，并有助于EV及患者遗传咨询。.总之，目前顺利完成了本项目设计计划，已经发表SCI英文论著2篇，中文核心期刊3篇，并在该项目研究基础上再次获得了国家自然科学基金的支持，将进一步深入研究高危型HPV致病机制。