先天性黑蒙动物模型的构建及致病机制研究

先天性黑蒙是基因突变引起的一种最严重的视觉失明的遗传病，目前缺乏有效的治疗手段。有效治疗策略的建立依赖于人们对致病分子机制的认识，而基于动物模型的研究不仅为揭示致病机制提供重要信息而且是探索治疗方案的必备工具。SPATA7突变诱发的视觉失明是先天性黑蒙的一种亚型，迄今为此，SPATA7突变如何导致视觉失明的分子机制还很不清楚。为揭示SPATA7突变诱发视觉失明的机制和探索其治疗方法，我们利用基因沉默技术建立了一种药物诱导SPATA7基因沉默缺的载体系统。在本项目中我们将利用这套载体系统建立由于SPATA表达下降而诱发的先天性黑蒙亚型的小鼠模型。通过比较正常小鼠与模型小鼠中视网膜的结构与形态、视网膜特异标志物的表达与胞内定位、细胞凋亡途径、视网膜电生理与离子通道功能分析以及蛋白与蛋白相互作用，不仅为阐明先天性黑蒙的分子病理机制提供一种重要信息，同时也为探索其治疗策略提供评估参数。

先天性黑蒙是基因突变引起的一种最严重的视觉失明的遗传病，目前缺乏有效的治疗手段。有效治疗策略的建立依赖于人们对致病分子机制的认识，而基于动物模型的研究不仅为揭示致病机制提供重要信息而且是探索治疗方案的必备工具。SPATA7突变诱发的视觉失明是先天性黑蒙的一种亚型，迄今为此，SPATA7突变如何导致视觉失明的分子机制还很不清楚。为揭示SPATA7突变诱发视觉失明的机制和探索其治疗方法，我们利用基因沉默技术建立了一种药物诱导SPATA7基因沉默缺的载体系统。在该系统中，我们设计了针对小鼠Spata7基因的四个shRNA序列，并将这四个shRNA序列构建与同一个载体中，该载体含有强力霉素基因，因此可通过强力霉素来诱导针对Spata7的四个shRNA的同时表达，达到沉默Spata7基因表达的目的。在本项目中我们利用这套载体系统建立了由于Spata7表达下降而诱发的先天性黑蒙亚型的小鼠模型。首先，我们对建立的小鼠模型进行了基因型鉴定，通过设计针对shRNA质粒的特异引物，提取模型小鼠的基因组DNA，通过特异引物进行PCR反应，确定模型小鼠的基因组DNA已经成功整合了针对Spata7的shRNA片段。为进一步证实小鼠模型已经成功建立，还利用免疫印迹和实时定量PCR的方法，确定经过强力霉素诱导的模型小鼠的Spata7的转录水平和蛋白水平的表达都有明显的降低。由此证明我们已经成功获得了Spata7基因沉默的小鼠模型。接下来，我们利用视网膜电图记录 (Electroretinogram，ERG)比较正常小鼠和模型小鼠视网膜对光反应的功能变化，发现在Spata7沉默的小鼠模型中，其视网膜的光的反应逐渐消失，最终导致完全没有反应。我们还通过HE染色和免疫荧光染色的方法比较了正常小鼠与模型小鼠中视网膜的结构与形态、视网膜特异标志物的表达与胞内定位、细胞凋亡以及蛋白与蛋白相互作用，不仅为阐明先天性黑蒙的分子病理机制提供一种重要信息，同时也为探索其治疗策略提供评估参数。