新型海洋生物纤溶酶溶栓活性分子机理研究

With emerge of severely ageing problem and significant side-effects for the clinic therapeutic drugs against thrombosis, it is therefore urgent and necessary to develop novel anti-thrombotic agents. After years efforts, we successfully isolated four different fibrinolytic enzymes components from Urechis unicinctus（UFE-I、-II、-III、-IV）, which all demonstrated significant anti-coagulant and fibrinolytic ability. Furthermore, we obtained the cDNA for two key components（UFE-II，III）. Although protein sequence alignment suggested that they all belong to trypsin-like serine protease, the study showed that UFE-II and UFE-III had significant difference in catalytic activity and substrate-binding specificity. UFE-II demonstrated stronger catalytic activity compared to UFE-III and lumbrokinases. We assume that substrate-binding pocket conformation is different between them, which might be the basis for activity difference and substrate specificity. To gain the insights for the molecular basis for the activity difference and substrate-binding specificity, firstly, we will clone and over-express the recombinant protein for these two novel marine fibrinolytic enzymes. Then we are going to explore the molecular mechanism for substrate-binding and catalysis through structural biology techniques in combination with site-directed mutagenesis. This study will not only facilitate the detailed understanding of catalysis mechanism for UFE, also provide the basis for development for novel anti-thrombotic agents using the structure-based protein engineering approach.

老龄化问题的加剧和临床溶栓药物副作用大都迫切需要开发新型抗血栓药物。经过多年研究，我们从单环刺螠中首次成功分离提取了一组纤溶酶（UFE-I，II，II，IV），研究发现它们具有抗凝和纤溶活性，并成功获得了两个关键组分（II，III）的cDNA。虽然序列比对显示它们都属于胰蛋白酶样丝氨酸蛋白水解酶，但研究发现它们在酶学活性和底物特异性上有很大差异。UFE-II溶栓活性好于UFE-III和蚓激酶。推测底物结合口袋蛋白构象不同是导致它们溶栓活性和底物结合特异性差异的结构基础。为深入研究UFE-II，-III药学活性差异的分子基础，计划首先利用重组表达技术在体外表达纯化重组UFE-II，III，然后利用结构生物学技术，结合定点突变从分子水平上阐明UFE-II，-III的溶栓机理和底物结合特异性。本项目的实施会加深对UFE溶栓活性分子机理的认识，为基于结构的新型溶栓药物开发提供基础。

随着人口老龄化及人们生活方式的改变，心脑血管疾病已经成为影响人民生活水平提高的主要原因。溶栓酶是心脑血管疾病预防与治疗的重要途径。当前的溶栓药物依然存在着成本高，半衰期短的问题。因此，新型天然溶栓剂是当前溶栓药物开发的重要方向。同时，开发海洋资源也是当前我们国家重要的战略目标。为此，在该项目基金的支持下，围绕着溶栓与酶这一主题，申请人主要开展了三方面的工作：1.完成了新型海洋生物溶栓酶的体外重组表达，活性及构效关系研究。建立了酶的体外重组表达体系，通过包涵体复性技术获得了有活性的溶栓酶，并利用多种技术研究了该重组酶的活性，验证了结构与活性的关系。2.完成了一种新型微生物来源的溶栓酶纯化，活性及晶体结构研究。获得了高纯度的微生物来源的类纳豆激酶。在进行活性研究的基础上，利用悬滴法获得了该酶的晶体。在上海同步辐射光源衍射后获得分辨率为1.8 Å的衍射数据，经过分子置换后解析了其晶体结构，相关结构数据已经提交到蛋白质数据库（PDB：5GL8）。该研究阐明此酶的作用机制，为其后续应用研究奠定了基础。3. 在项目支持下，申请人还开展了海洋多糖水解酶的发现研究。获得了多种新型的多糖水解酶。.在该项目的支持下，申请人完成了对两种重要的天然溶栓酶及海洋多糖水解酶的研究。成功解析了其中一个酶的三维结构。由于天然溶栓酶药物开发的迫切性和重要性，在该研究基础上，山东睿鹰集团就溶栓酶在海洋药物领域的开发研究与申请人课题组签订了五年（2014-2018）的联合研究开发协议，项目组获得了集团150万元产学研项目资助，进行该酶的深入研究开发。迄今部分研究成果已发表研究论文2篇，另外1篇正在投稿中，还有1篇在撰写中，后续相关的研究正在开展中。