山龙眼属植物酚苷类化学成分豆腐果苷调控NGF/TrkA-TRPs通路发挥抗神经病理性疼痛作用机制研究

NGF/TrkA-TRPs is the key pathway for neuropathic pain. Helicid, phenolic glycosides from Helicia Lour, produce exact curative effect on neuropathic pain. However, it is still unclear for the target and mechanism of the drug. Our previous study on helicid implied a correlation between its effects and NGF/TrkA-TRPs pathway: effect duration, tissue distribution characteristics, and its antagonistic effect to reverse the neural cell differentiation induced by NGF. Accordingly, the applicant proposes a scientific hypothesis: “Helicid inhibits NGF/TrkA-TRPs pathway, reduce expression and activity of TRPs, and result in its anti-neurogenic pain effect". Applicant will identify the effects of helicid on joints on NGF/TrkA -TRPs on cellular level. In vivo study will be conduct to indentify the correlations between the effect duration of helicid and changes in each element of NGF/TrkA-TRPs pathway. Finally, an anti-neuropathic pain PK-PD combined model for helicid will be established to further confirm the mechanism of helicid. The study will elucidate the anti-neuropathic pain mechanisms of helicid, provide a reference for activity study on phenolic glycosides from plants, and lay a theoretical basis for the design and development of new drugs.

NGF/TrkA-TRPs通路是产生神经病理性疼痛的关键通路。山龙眼属植物中酚苷类化学成分豆腐果苷具有确切的抗神经病理性疼痛作用，但药效作用靶点及机制未明。申请者前期研究发现豆腐果苷的药效作用时程、组织分布特征、拮抗NGF诱导的神经细胞分化作用，均与NGF/TrkA-TRPs通路显示极大相关性。据此申请者提出科学假设：“豆腐果苷通过抑制NGF/TrkA-TRPs通路，减少TRPs的表达和活性，从而产生抗神经病理性疼痛作用”。申请者拟通过细胞水平研究明确豆腐果苷对NGF/TrkA-TRPs通路各环节的作用；整体水平考察豆腐果苷药效时程与NGF/TrkA-TRPs通路各环节时程变化的相关性；最后，构建豆腐果苷抗神经病理性疼痛作用PK-PD结合模型，进一步阐释其药理作用机制。上述研究将阐明豆腐果苷抗神经病理性疼痛机制，为同属植物酚苷类化学成分的活性研究提供借鉴，为新药设计与开发提供理论依据。

通过本项目的开展，我们从体外研究，细胞模型，及动物模型等层次考察豆腐果苷抗神经病理性疼痛的药效学及药动学特征，并分析其内在机制。主要内容分为下列七个部分：① 成功构建坐骨神经慢性压迫性神经痛模型并开展基于病理模型的药效学研究，开展组织病理试验制备组织芯片，采用免疫组化方法分析模型大鼠左右两侧背根神经节的TrkA及TRPV1表达情况。② 成功绘制出豆腐果苷体内代谢产物网络图，鉴定出16种代谢产物；③ 对鉴定出的代谢产物进行合成、购买，考察了豆腐果苷及其代谢产物对GABA代谢酶（SSADH 酶与GABA-T 酶）的抑制作用；④建立并验证了豆腐果苷及其主要Ⅰ相代谢产物定量研究的UFLC-ESI-MS/MS分析检测方法。豆腐果苷及两种Ⅰ相代谢产物的定量下限（LLOQ）均为1ng/mL，线性浓度范围为0.001-10µg/mL。该方法选择性，线性，准确度和精密度，回收率，离子抑制率，后遗效应，残留，稀释可靠性，稳定性均符合要求。⑤ 豆腐果苷及其代谢产物在单剂量与多剂量给药方式下药代动力学的比较研究发现，还原产物（对羟甲基苯-O-ß-D-吡喃阿洛糖苷）在多次给药情况下，还原产物的生成量大于原药豆腐果苷含量。⑥ 豆腐果苷在正常与坐骨神经慢性压迫性神经痛模型大鼠体内的组织分布对比研究结果显示，在疾病病理状态下，机体对豆腐果苷原药的血脑屏障通透能力和体内处置过程均较之正常状态发生显著差异。同时，在病理状态下，两种性别大鼠长期给予豆腐果苷，较之正常组和CCI模型空白对照组大鼠，均表现出显著性体重增幅下降。⑦ 完成后续研究所需共表达相关GB1表达载体（GABA-GB1-TRPV1）的构建为进一步机制探索奠定基础。