TetR家族蛋白，SCO3201，在天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌中下游调控靶基因的鉴定及功能分析

Streptomyces coelicolor and Streptomyces lividans are two model strains of great interest to study the regulation of antibiotic biosynthesis. Indeed, the two strains contain the same functional biosynthetic pathways for secondary metabolites biosynthesis but the latter are weakly expressed in S. lividans and strongly expressed in S. coelicolor. The genomes of these two species include 151 regulators of the TetR family and we have previously demonstrated that the over-expression of one of them (SCO3201) totally switch off the antibiotic production and sporulation in S. coelicolor, but not in S. lividans. The main goal of this study is to identify the downstream regulatory target genes of SCO3201 in S. coelicolor and S. lividans, and to assess their involvement in the antibiotic production. This work is expected to lead a better understanding of the regulatory circuit controlling antibiotic production in Streptomyces lividans and Streptomyces coelicolor, and might allow the identification of the genetic changes underlying the drastically different capabilities of these two strains to produce antibiotic. This understanding should open the possibility, in the future, to transform each Streptomyces strain to S. coelicolor-like over-producing strain by appropriate genetic engineering strategies and thus facilitate the discovery of most needed novel antibiotics.

TetR家族转录调控因子SCO3201的过量表达对天蓝色链霉菌的抗生素生产及孢子形成均产生强烈的抑制作用，而对与天蓝色链霉菌有很近亲缘关系的变铅青链霉菌却没有明显的作用。本课题以此现象为基础，计划在二宿主中分别鉴定SCO3201的调控靶基因，并逐一分析靶基因在各自宿主中对抗生素生产及形态分化的作用；分析SCO3201在靶基因启动子区域准确的结合位点；明确SCO3201在胞内对各靶基因转录的调控作用；对比解析SCO3201在天蓝色链霉菌及变铅青链霉菌二宿主中靶基因身份，功能，调控应答等的异同。预期取得的研究成果，不仅可以更全面的鉴明链霉菌次级代谢及形态分化的调控网络，而且还可以为进一步揭示和完善天蓝色链霉菌及变铅青链霉菌抗生素生产调控网络的差异提供支持，解析基因沉默的分子机理，以便日后将模式菌株沉默基因的研究经验应用于急需抗生素的激活与利用上。

天蓝色链霉菌与变铅青链霉菌是研究基因沉默、激活的较好模式素材。申请者在前期工作中发现了一个在二者中均存在的TetR 家族转录调控因子SCO3201，其过量表达在天蓝色链霉菌中几乎完全抑制了抗生素（CDA, RED 及ACT） 的生产及孢子形成，而在变铅青链霉菌中对抗生素RED 的生产及孢子形成却没有明显的作用。此现象说明SCO3201 对二宿主的调控在途径上存在显著差异。本研究在此前期数据基础上，分别在天蓝色链霉菌及变铅青链霉菌中分离并鉴定出14个潜在的SCO3201调控靶基因，并采用EMSA技术确认了其中的8个靶基因启动子可与SCO3201蛋白特异性结合，而后采用RT-PCR技术分析了SCO3201对各靶基因转录表达的调控作用。在研究靶基因的功能过程中发现,转录调控蛋白WblI (SCO5046)的过量表达显著激活了变铅青链霉菌ACT抗生素的生产，其敲除使原本低表达的RED抗生素的产量进一步减少，而且，wblI在天蓝色链霉菌中的表达量高于变铅青链霉菌。上述实验结果说明转录调控蛋白WblI对于二宿主抗生素生产能力十分重要。为进一步明确WblI的功能，本研究在变铅青链霉菌中对WblI的下游调控靶基因进行了鉴定。共得到5个下游调控靶基因，分别为潜在转录因子WblA、WblI本身、参与ACT抗生素合成的蛋白ActVA3，负责ACT胞外运输的转运蛋白ActII-2及ActII-1。本课题通过凝胶阻滞实验验证上述靶基因启动子区域与WblI蛋白的直接结合。而后采用MEME软件将各靶基因启动子作比对，确认保守序列区域位置，并分析出2个有较高相似度、并在启动子区域重复出现的DNA基序：CTTCGA(G/C)和CTTGACGC。研究中采用RT-PCR进一步分析了WblI对靶基因转录的调控作用，结果表明WblI对actVA3及actII-2起正调控作用，而对wblA及actII-1起负调控作用。上述结果说明，WblI是转录因子SCO3201的主要调控目标，WblI通过直接调控actVA3及actII-1基因的表达最终实现对链霉菌抗生素ACT的生产及胞外运输。WblI可能通过调控下游调控靶基因wblA的表达实现对链霉菌形态分化的调控。本研究的实验结果不仅进一步完善了链霉菌次级代谢及形态分化调控网络，还为日后急需抗生素的开发提供了研究思路和理论基础。