构建Egr-1启动子驱动的Mn-SOD表达载体及其靶向性辐射防护和放疗增敏效应

For the clinical practice of radiotherapy, damages of normal tissues and resistant to radiation of tumor cell remain to be the major problem required to be addressed. Up to now, the existing radiation modifiers often can not recognize the difference between the normal and cancer cells, which usually protect the tumor cells in a same way as normal tissues, or radiosensitize normal cells in a same manner as cancer cells. Therefore, there is a urgent need to explore some strategies to settle above questions by targeting the protection to normal tissues or tumor-directed radiosensitization. Latest studies found that manganese-containing superoxide dismutase(Mn-SOD) was not only a reliable protection agent to normal tissues, but also a potent radiosensitizer of tumor cells, which might turn into an ideal radiation modifier in tumor radiotherapy. The promoter of early growth response-1(Egr-1) is a radio-inducible regulatory sequence, which can control the expression of downstream genes in a time and space restricted manner showed in our former studies. In present research, the Egr-1 promoter will coupled with Mn-SOD cDNA to generate a construct utlizing the lentiviral vector, which will further be transduced into human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE1 and human fibroblast cell HFS, and the radio-protective actions and tumor radiosensitization effeccts will be evaluated in futher in vitro and vivo experiments. This study aids to establishe a novel pathway to protect normal tissues and tumor radiosensitization in a dual-action manner.

在肿瘤放疗中，瘤周正常组织损伤和肿瘤抗拒一直是困扰临床实践的核心问题，现有的放疗修饰剂往往"敌我不分"，保护正常组织的同时也降低了肿瘤敏感性，或者增敏肿瘤的同时也加重了正常组织损伤。因此，亟待探索靶向正常组织的放射防护或肿瘤特异性增敏手段。晚近研究表明，超氧物歧化酶（Mn-SOD）同时具有正常组织放射防护和肿瘤细胞增敏的"双重角色"，是一种理想的放射治疗修饰剂，但其靶向性表达调控尚待解决。Egr-1启动子是放射诱导性调控序列，利用该启动子在射线作用下可以精确控制下游目的基因在特定的时间和空间内量化表达。本项目拟将Egr-1启动子与Mn-SOD相耦联构建慢病毒表达载体，利用放射线调控Mn-SOD在照射野的靶向性高效表达；分别转染鼻咽癌CNE1细胞和成纤维细胞HFS，以及鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，通过体内外实验观察其放射防护和肿瘤增敏效应，探索一种兼具靶向防护和靶向增敏"双重效应"的放疗修饰手段。

研究背景：放疗是肿瘤综合性治疗中不可或缺的核心技术之一，在对肿瘤的局部控制中，辐照不可避免的会对肿瘤周围的正常组织造成损伤。为降低辐照对正常组织的损伤，辐照的剂量和时间会受到严格限制，在一定程度上也制约了放疗的治疗效果。多叶准直器、精确的固定技术、辐射防护剂等常用来减轻放射性损伤，但是效果并不理想，并且辐射防护剂缺乏靶向性，同时也会对肿瘤组织起到保护作用，从而降低了放疗的效果。放疗增敏剂也存在类似的问题，在对肿瘤起到放疗增敏效应的同时，往往也会增强照射野内正常组织的敏感性，导致放射损伤加重。也就是说，现有的肿瘤放射增敏剂和正常组织辐射防护剂缺乏特异性, 增敏肿瘤时正常组织损伤加重，保护正常组织时肿瘤疗效下降；多年来一直未能在增敏肿瘤时实现对正常组织的保护。.研究内容：（1）pEgr-1/GFP、pEgr-1/SOD 等重组载体的构建， 鉴定，扩增，提取。（2）慢病毒载体的包装、提纯、滴度测定等，细胞培养，基因转 染；（3）Egr-1 启动子驱动报告基因 GFP 表达载体的辐射诱导性鉴定以及基因表达的时空限制特异性验证。（4）体外实验观察治疗载体pEgr-1/SOD 的对成纤维细胞的辐射防护作用和肿瘤细胞增敏效应，以及（5）体内验证所构建载体的靶向增敏和防护效应。.主要结果：（1）由串联的CArG盒和CMV基础启动子构成的嵌合型启动子具有明显的辐射诱导特性，驱动下游基因时间特异性表达，并呈现明显的辐射剂量依赖性。（2）体外实验证明，放射敏感性嵌合型启动子驱动SOD2基因表达，对肿瘤细胞具有显著放疗增敏效应，能有效抑制肿瘤细胞的增殖和生长。（3）裸鼠移植瘤实验表明，辐射诱导的SOD2表达对肿瘤组织呈靶向性增敏作用，对正常细胞和组织有辐射保护作用，降低辐射野内正常细胞的凋亡率。.科学意义：本项目为肿瘤放疗靶向性增敏和组织保护提供了新的技术方案和路径。优化了射线敏感性调控序列，增强了靶基因的表达水平。筛选出了敏感细胞株和肿瘤类型。