微泡内物质恶性转化黏膜干细胞与口腔癌复发关系的研究

口腔癌占全身恶性肿瘤死亡率的近1/10，预后极差，其局部复发成为治疗失败的主要原因。最新研究表明微泡是恶性肿瘤细胞物质传递的主要方式之一，可能在口腔癌的侵袭、复发中起关键作用。本课题拟采用蛋白组学检测技术、基因转染及沉默、干细胞分选等现代分子生物学技术，以及细胞培养、动物试验等手段，了解癌细胞微泡产生的主要因素及相关信号通路，分析微泡内引起细胞恶性转化的关键分子物质，掌握正常细胞接受恶性物质后的生长特性及其控制恶性表型的平衡物质状态，获得控制恶性潜能细胞或休眠细胞激活的关键基因，并建立复发动物模型进行验证；同时针对复发关键分子，通过上调或干扰基因表达验证关键基因功能，以阐明细胞物质传递方式与复发的分子物质基础，以期从全新角度认识口腔癌复发过程的分子机制，从而为开拓全新的口腔癌治疗策略奠定坚实的理论基础。

近年来研究发现微泡是肿瘤细胞物质传递的主要方式之一，表达表皮生长因子受体的胶质瘤细胞可以产生微泡，促进邻近的良性细胞恶性转化；因此，我们认为，在口腔癌复发过程中存在一种重要的途径和机制——癌细胞在被彻底清除前已将其内的恶性物质通过微泡传递到附近或更远的细胞内，这些细胞虽然形态学正常，但遗传物质已发生变化，处于潜在恶性状态，当细胞控制癌变的机制失灵，造成复发及病灶形成。针对课题设想本项目展开以下研究内容：首先比较提取微泡的不同方法确定最佳提取方案；采用双向串联质谱分析比较正常细胞及肿瘤细胞来源微泡的差异蛋白的表达，寻找可疑治病因子；结合免疫组化，WB及RT-PCR进一步确定差异蛋白的表达情况及其与肿瘤恶性程度的相关性；通过DiI膜染料观察肿瘤来源微泡与HOK细胞的作用过程，并结合MTT，流式细胞技术及Transwell技术测定分析融合细胞生物学行为的变化。应用蛋白芯片技术检测融合细胞ERK通路磷酸化水平的变化；结合动物成瘤实验进一步探查融合细胞的成瘤情况。通过上述研究获得如下重要结果及其科学意义：对比密度梯度离心法及差速离心法提取微泡的优劣，首次证实了密度梯度离心法提取微泡纯度及数量具有明显优势，更适合实验研究；双向电泳并串联质谱检测舌鳞癌Tca8113及HOK细胞来源微泡的差异蛋白表达，首次发现了K-sam蛋白在舌鳞癌来源微泡中高度表达，形成的差异表明可能成为舌鳞癌细胞恶性行为传递的关键分子，K-sam蛋白极有可能在舌癌Tca8113细胞系来源的微泡中富集，并通过微泡传递至远处并转染正常细胞，可能对肿瘤微泡恶性转化周围正常粘膜上皮细胞，促进肿瘤的扩散,转移,复发起重要作用；进一步临床病理研究证实舌鳞癌组织中K-sam的表达与肿瘤的恶性程度及转移密切相关，可能成为肿瘤诊断及恶性程度的预测指标；DiI膜染料成功观察到了细胞摄取微泡的不同方式：雪旺细胞RSC96以內吞作用摄取微泡，HOK细胞以包膜融合摄取微泡；MTT、FCM、Transwell方法检测融合Tca8113细胞来源的微泡后HOK细胞增殖、迁移能力增强，表明HOK融合细胞承载了舌癌Tca8113细胞基本的增殖、迁移能力，具有潜在恶性；首次提出Tca8113细胞可外泌富含蛋白因子的微泡，使CREB、Elk-1、MSK1、STAT3等核內转录因子磷酸化水平上调，可能激活ERK细胞通路并促进HOK细胞的增殖。