冠状病毒3CL蛋白酶成熟机制研究

冠状病毒3CL蛋白酶可切断冠状病毒复制酶基因表达的多聚蛋白的大部分位点，释放出病毒生理周期所必需的各种因子，被认为是抗冠状病毒的重要靶标。3CL蛋白酶在成熟前是复制酶基因产物多聚蛋白的一部分，因此在行使主蛋白酶的功能前首先要从多聚蛋白中自切下来，完成自成熟过程。目前有关3CL蛋白酶成熟过程的尚不是很清楚。本课题利用在SARS和TGEV 3CL蛋白酶（nsp5）的两端连接上病毒多聚蛋白中真正的连接蛋白的方法，构建由nsp4-nsp5-nsp6组成的多聚蛋白，通过酶动力学，分析型超速离心及蛋白交联的方法研究该多聚蛋白的结构与酶催化活性关系，在此基础上建立冠状病毒3CL蛋白酶的成熟机制。揭示冠状病毒3CL蛋白酶成熟过程的机制，不仅有助于我们了解冠状病毒和其它病毒的自组装过程，还将为我们深入了解蛋白结构与功能以及设计针对冠状病毒的广谱抑制剂提供理论基础。

冠状病毒的3CLP在病毒生命周期中起关键作用，被认为是抗冠状病毒的重要靶标。3CLP在成熟前为病毒编码的复制酶多聚蛋白的一个结构域，需要从母体蛋白中自切成熟后才能发挥功能。该项目原计划在3CLP两端连上其在母体多聚蛋白中的相邻序列（nsp4和nsp6），构建nsp4-3clp-nsp6融合蛋白来研究冠状病毒3CLP的成熟过程。因为nsp4和nsp6是疏水性很强的膜蛋白，在体内和体外都检测不到融合蛋白的表达，所以我们用荧光蛋白代替了nsp4和nsp6，构建了荧光多聚蛋白CFP-XX-3CLP-YFP及其衍生物模型，并将3个冠状病毒的3CLP引入该模型，使用沉降速率，凝胶色谱以及酶动力学方法研究该酶成熟过程中蛋白结构与酶活性的关系。研究结果表明在蛋白酶成熟过程中，二聚体是蛋白酶的活性形式，而且底物具有诱导蛋白酶二聚的作用，这与已有的SARS-3CLP成熟过程一致，所以冠状病毒3CLP可能遵循相同的自成熟机制，这为合理的设计抗冠状病毒的广谱抑制剂提供了依据，同时也使我们更深入地了解了蛋白酶结构与功能的关系。. 如上所述，二聚化对3CLP活性调控起着至关重要的作用，至今为止仍未发现有活性的单体存在。我们对SARS-3CLP有活性的二聚体和无活性的单体的晶体结构进行比较，在无活性的单体基础上对蛋白酶进行改造，最终得到了有活性的单体，并通过分子动力学模拟对单体蛋白酶的活性给出了的理论解释。对活性单体的设计一方面可以加深我们对3CLP 活性调控机制的理解，另一方面也可以提供3CLP进化上的一些线索。