日本结缕草SGR介导NYC1调控叶绿素b降解的分子机制

The shorter green period of Zoysia japonica is becoming a prominent barrier preventing its market promotion in China, highlighting the importance of better understanding its chlorophyll degradation mechanism. We have interpreted the function and the transcriptional regulation mechanism of STAY-GREEN gene (SGR) from Zoysia japonica in our previous study. It was found that SGR could activate the expression of Non-Yellow Coloring 1 (NYC1) and consequently decrease the chlorophyll b content. However, the underlying mechanism of this new observation is still unknown. This project intends to clone ZjNYC1, investigate its function and explore the regulating mechanism in controlling chlorophyll b degradation. To investigate the upstream regulating mechanism of ZjNYC1, yeast One-Hybrid screening, EMSA and firefly luciferin assay will be utilized to screen potential transcription factors which can bind to the promoter and regulating the expression of ZjNYC1. Then the molecular mechanism of ZjSGR regulating ZjNYC1 will be proposed base on the results of RNA-sequencing results and physiological metabolism of transgenic lines. This project will not only enrich our knowledge of the chloroplast-to-nucleus communication in the process of chlorophyll degradation, but also provide theoretical basis in the green period management of Zoysia japonica in practice.

较短的绿期限制了结缕草的进一步推广应用，诠释结缕草叶绿素降解的分子调控机制对于结缕草绿期调控愈发重要。申请人前期工作发现日本结缕草滞绿基因SGR可促进叶绿素b还原酶基因NYC1的表达，且加速了叶绿素b的降解。然而，SGR介导NYC1调控叶绿素b降解的分子机理仍不清楚。本项目拟在此基础上，对日本结缕草ZjNYC1基因进行克隆，通过转基因的方法分析其在叶绿素b降解中的作用及转录调控机制。利用酵母单杂、EMSA和荧光素酶系统筛选可结合ZjNYC1基因启动子的转录因子，探析ZjNYC1的上游调控机制。通过分析转基因株系的转录组和生理代谢变化，挖掘ZjSGR调控ZjNYC1的途径，解析ZjSGR通过介导ZjNYC1调控叶绿素b降解的分子机制。研究结果将不仅有助于丰富我们对叶绿素降解过程中的叶绿体-细胞核的信息交流的认识，而且还能够为结缕草的绿期调控和管理提供理论依据。

结缕草(Zoysia spp. Willd.)是我国的优良乡土草坪草，是目前少有的不依赖进口的草坪草种之一，对促进我国草种业的健康发展具有重要意义。然而，较短的绿期限制了结缕草的进一步推广应用，系统诠释结缕草叶绿素降解的调控机制十分必要。本研究在前期滞绿基因（SGR）功能研究的基础上，进一步选择叶绿素降解通路中的叶绿素b还原酶基因NYC1为切入点，系统解析了其在调控叶绿素降解和光合作用中的机制。首先，克隆获得了结缕草ZjNYC1基因（GenBank登录号：MW838182）及其启动子序列。本生烟草和结缕草原生质体中的亚细胞定位结果均证明ZjNYC1定位于叶绿体。同时克隆了叶绿素b还原酶的另一个基因ZjNOL，在本生烟草、结缕草原生质体和酵母中研究了两个叶绿素b还原酶的互作情况，结果证明ZjNYC1和ZjNOL的互作需要SGR的介导。其次，转基因试验证明了ZjNYC1能够促进叶绿素降解，并加速叶片衰老。对ZjNYC1过表达株系进行了转录组测序和叶绿素荧光动力学曲线的联合分析，结果发现ZjNYC1可通过抑制PSII、PSI和中间电子传递系统来抑制光合作用。卡尔文循环和光呼吸作用效率也受到了抑制，导致碳同化降低，抗氧化系统受到紊乱。还发现ZjNYC1可激活ABA和乙烯的信号转导和生物合成通路。此外，在构建高质量结缕草衰老叶片cDNA文库的基础上，利用酵母单杂筛库获得了能够结合ZjNYC1启动子并激活其表达的转录因子ZjMYB，探析了ZjNYC1的上游调控机制。利用基因编辑技术敲除结缕草ZjSGR基因，获得了ZjSGR敲除株系。分析了ZjSGR基因对ZjNYC1功能的影响，发现ZjNYC1表达降低，并且叶绿素b含量高于对照，表明ZjSGR介导了ZjNYC1对叶绿素b降解的调控。综上所述，本研究揭示了ZjSGR对ZjNYC1的介导作用，证明了ZjNYC1在促进叶绿素降解、叶片衰老和破坏光系统的结构和功能等方面具有重要作用，为结缕草遗传改良提供了理论依据。