大白菜花粉发育相关的三个孤基因(Orphan gene)的表达分析与功能鉴定

All sequenced genomes contain orphan genes, which exhibit no sequence similarity to any genes in other species or lineages. Previously, three orphan genes, Bra039133, Bra023194 and Bra015539, have been isolated from Br300K microarray analysis in Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis), which showing specifically expressed in fertile plant floral buds. Furthermore, co-expression analysis indicated all of them involved in pollen development process. To characterize the functions of these three genes during pollen development in Chinese cabbage, the qRT-PCR, promoter fusion and in stiu hybridization will be used to determine the precise expression pattern of targeted genes. Then over-expression, RNAi and Crispr/Cas9 technologies will be used for charactering the functions of targeted gene during pollen development. Morphological, palynological, physiological and metabonomical difference of the transgenic plants will be examined to analyze the biological functions of targeted genes. This research will provide a reference for the functional analysis of orphan genes in Chinese cabbage, increase our knowledge of orphan genes and the understanding of molecular mechanisms of pollen development, and provide the new gene source for artificial control of the male fertility for Chinese cabbage and creating new male sterility system for breeding.

孤基因存在于所有已经完成测序的基因组中，具有无法在其他物种或谱系中找到序列相似基因的特点。项目前期通过芯片分析获得了三个大白菜雄性不育系可育植株花蕾特异性表达的孤基因（Bra039133, Bra023194和Bra015539）。进一步的共表达和GO富集分析显示其可能参与了花粉的发育过程。为明确其功能及探讨孤基因在花粉发育中的作用。本项目将运用qRT-PCR、启动子融合表达等技术明确三个孤基因的切确表达位置，通过构建过表达、RNAi抑制及Crispr/Cas9敲出载体进行遗传转化，分析转化植株的形态学、孢粉学、生理特性及代谢产物等的差异，明确此三基因在花粉发育中的功能。研究结果将为后续大白菜中的孤基因功能研究提供参考，丰富对孤基因的认知，丰富对花粉发育过程分子机理的理解，为人为控制大白菜育性，人为创建雄性不育体系提供新的基因源。

孤基因也叫系谱特异性基因，广泛存在于生物体中，常与生物体的特异性性状或环境适应性相关联。该项目通过基因芯片从三个大白菜雄性不育系的可育系中分离到了三个特异性表达的谱系特异性基因，分别为十字花科特异性基因（Bra039133）、芸薹属特异性基因（Bra023194）和大白菜特异性基因（Bra015539）。为明确三个基因的功能，首先对三个基因的共表达成员进行了分析，并通过GO富集化分析进一步揭示三个基因可能与花粉发育相关联。通过qRT-PCR分析表明三个基因在话器官中呈现高表达，通过GFP融合载体分析表明三个基因均定位于细胞核内，通过RNAi沉默的验证了Bra039133与花粉发育相关联。在分析Bra039133基因的RNAi沉默转基因植株时发现BrBGLU10基因的表达模式降低，为更好的理解BrBGLU10基因的功能，我们对BrBGLU家族成员进行了系统的分析，明确了可能与花粉发育相关的成员信息，并通过共表达分析发现BrBULU10和其拟南芥同源体在花粉发育过程中生物学功能保守，并通过反义链沉默进行了验证。同时，为了更好的理解孤基因在大白菜中的功能，我们对大白菜中的各类孤基因进行了系统全面的分析，初步预判了它们的生物学功能。该研究增进了对大白菜花粉发育和孤基因功能的理解。