GATA家族蛋白在猪早期胚胎滋养层中对于Oct4基因表达调控的研究

The mechanism of trophoblast（TE） and inner cell mass（ICM）differentiation is the most basic question in developmental biology. It has been demonstrated that the expression pattern of the key factor for ICM differentiation, OCT4, was not consistent among different mammalian species. OCT4 specific expressed in mouse ICM at blastocyst stage. But it could be detected in both TE and ICM in pircine, cattle and goat blastocysts. This suggests that the molecular basis of mammalian early embryonic development may be not conserved. However these phenomenon has not been revealed clearly. The applicant made a comparation of the regulatory region for Oct4 gene and found an unconserved GATA family protein target in Oct4 gene upstream. The result of preliminary experiment showed that this traget was involved in the regulation of Oct4 expression. Based on these background and findings, the applicant proposed that GATA family protein may promote Oct4 expression in pircine TE cells in a transcriptional activation way. In addition, the continuous high expression level of OCT4 in porcine TE may play a key role in TE cell fate determination, development and function. So the applicant make an application for this project. It would supplement the konwledge for the mechanism of TE and ICM differentiation though the study.

滋养层（TE）和内细胞团（ICM）分化机理是发育生物学最基础的科学问题。研究表明，ICM分化的关键因子OCT4的表达模式存在物种特异性。在小鼠囊胚中OCT4在ICM特异性表达，但是在猪、牛和羊等物种中OCT4在囊胚TE和ICM中广泛表达。这种现象反应了哺乳动物早期胚胎发育的分子基础在物种间可能不保守，但至今这种现象也没有得到解释。通过系统对比分析多个物种OCT4上游调控区域序列，申请者发现了一个不保守的潜在的GATA家族蛋白结合位点。前期预实验结果表明这个位点参与到OCT4表达调控中。基于此，申请者率先提出猪早期胚胎中GATA家族蛋白可能通过转录结合的方式促进Oct4基因在TE中表达的推测。此外，OCT4在猪滋养层中持续高表达也可能对TE细胞命运决定以及其发育和功能维持具有重要的生物学意义。因此申请者提出本课题，通合理的实验设计回答上述问题从而补充对于哺乳动物TE与ICM分化机理的认知。

滋养层（TE）和内细胞团（ICM）分化机理是发育生物学最基础的科学问题。研究表明，ICM分化的关键因子OCT4的表达模式存在物种特异性。在小鼠囊胚中OCT4在ICM特异性表达，但是在猪、牛和羊等物种中OCT4在囊胚TE和ICM中广泛表达。这种现象反应了哺乳动物早期胚胎发育的分子基础在物种间可能不保守，但至今这种现象也没有得到解释。.本次研究中，通过系统对比分析多个物种OCT4上游调控区域序列，我们发现了一个物种间不保守的潜在的GATA家族蛋白结合位点。通过点突变、报告基因表达载体构建以及胚胎显微注射等实验方法研究发现，这一位点对于Oct4基因在猪滋养层细胞中的表达是必须的。另一方面，我们通过qPCR、慢病毒干扰、mRNA过表达以及免疫荧光等实验方法从GATA家族中筛选并明确GATA4蛋白参与调控Oct4基因在猪早期胚胎滋养层中的表达。结合以上研究结果，我们进一步通过荧光素酶报告系统以及凝胶迁移实验明确了GATA4通过直接结合该位点参与调控Oct4基因的表达。此外，通过体内和体外实验，我们明确了OCT4在猪滋养层中持续高表达的生物学意义。猪囊胚滋养层特异性干扰Oct4对早期囊胚的形成以及细胞数都没有显著影响，但将干扰后的第6天囊胚移植到体内继续发育2天后冲取出的晚期囊胚大小以及细胞数明显小于对照组，TUNEL检测表明干扰Oct4后的胚胎细胞凋亡率显著升高。而体内继续发育3天后的干扰组囊胚大小仅为对照组的1/2，并且发生大面积细胞凋亡。.综合以上结果，我们在分子水平上阐明了胚层分化关键调控因子OCT4在猪与小鼠早期胚胎中表达模式差异的原因，同时我们发现了这种差异性的表达模式对于猪的囊胚的正常发育是必须的。这一科学问题的回答，对于我们进一步认识哺乳动物滋养层与内细胞团分化过程和机理以及发掘Oct4 基因在哺乳动物胚胎发育和命运决定中的新功能奠定了基础。