Src蛋白激酶抑制剂影响氟尿嘧啶诱导的结肠癌细胞凋亡的机制研究

Src is a well-known non-receptor tyrosine kinase that tightly relate to tumor formation and development. Src is over expressed in colon cancer.Results from recent phase 3 clinical trials indicated that the addition of tyrosine kinase inhibitors to traditional chemotherapeutic drug did not improve overall survival for a group of metastatic colon cancer, but showed a poorer safety profile. Our preliminary data showed there is lower Src expression in recurrent cancer compared to original cancer in patients who received 5-Fu based chemotherapy, which indicated that tumor recurrence maybe because cancer cells expressing lower Src lost sensitivity to chemotherapy. Dasatinib decreased colon cancer cell apoptosis induced by 5-Fu, indicating Src kinase inhibitors maybe not suitable in combination with 5-Fu. However, the mechanism of this phenomenon is not clear. The aim of this project is to further identify this unsuitable combination in colon cancer therapy, find the mechanism on how dasatinib influences colon cancer cell apoptosis induced by 5-Fu, and study if caspase-9 activity can be regulated by Src phosphorylation and influence cell apoptosis. Moreover, we try to establish patient derived xenograft model of colon cancer and explore how to use Src kinase inhibitor for colon cancer treatment, which can provide solid theoretical evidence for clinical use.

Src是一种与肿瘤的发生发展密切相关的非受体酪氨酸激酶，在结肠癌中高表达。三期临床试验结果显示酪氨酸激酶抑制剂与传统化疗药物联用不改善转移性结肠癌患者的生存期，并导致更严重的安全问题。我们的预实验发现，同一患者接受以氟尿嘧啶为基础的化疗后其复发转移癌中Src表达较原发癌减少，提示癌症复发可能因为Src低表达癌细胞对化疗不敏感。达沙替尼联用氟尿嘧啶导致氟尿嘧啶诱导的结肠癌细胞凋亡减少，提示Src激酶抑制剂或不适合与氟尿嘧啶同时应用，但其作用机制有待进一步阐明。本项目旨在进一步证实达沙替尼不宜与氟尿嘧啶联用于结肠癌化疗，阐明达沙替尼影响氟尿嘧啶诱导的结肠癌细胞凋亡的机制，研究Src磷酸化调控caspase-9活性对细胞凋亡的影响；建立患者来源结肠癌异体种植模型，探索Src激酶抑制剂治疗结肠癌的正确应用方法，为临床应用提供切实的理论依据。

临床研究显示达沙替尼与常规化疗联合在晚期结肠癌患者中未能显示生存获益，我们提出疑问Src激酶抑制剂是否适合与化疗药物联合治疗结肠癌。 本研究旨在探讨达沙替尼是否干扰5-FU引发的结肠癌细胞凋亡。 结果显示Src能够直接结合及磷酸化caspase-9（Y251），导致caspase-9活性升高。 达沙替尼通过抑制Src活化从而显著下调5-Fu诱导的结肠癌细胞凋亡。 我们的发现部分阐述了在mCRC中达沙替尼与FOLFOX联合用药并未显示出临床效果的理论依据。具体研究结果如下：.1.研究src与caspase-9相互作用及机制：体外激酶实验证实src可磷酸化caspase-9，通过NetPhos 3.1软件系统预测caspase-9可能被磷酸化的5个位点，然后设计合成这5个肽段，分别用这五个肽段与活性src反应，结果证实caspase-9 的Y251位点可被src强磷酸化。突变caspase-9 的Y251位点再次与src反应，结果证实caspase-9磷酸化明显减弱，表明caspase-9 的Y251位点是src磷酸化的最重要的位点。免疫共沉淀结果显示在结肠癌细胞系src与caspase-9内源性结合，免疫荧光实验结果表明src与caspase-9共定位。.2.研究src磷酸化对caspase-9活性的影响：共转染组PARP，caspase-3和caspase-7裂解物表达显著增加，提示Src促进caspase-9相关凋亡通路。使用caspase-9活性试剂盒检测单独转染His-Src，caspase-9或两者共转染的293T细胞以测试细胞内caspase-9活性，结果显示共转染组caspase-9活性呈时间依赖性模式显著升高。以上结果表明,在结肠癌细胞中src可增强caspase-9活性。3.研究达沙替尼对src活性及5-Fu诱导的结肠癌细胞凋亡的影响：通过MTS实验确认达沙替尼既抑制结肠癌细胞Src活性又不产生细胞毒作用的有效浓度，对比联用达沙替尼和单用5-Fu对结肠癌细胞凋亡的影响，结果表明达沙替尼可通过抑制5-Fu 引起的src激活减弱5-Fu诱导的结肠癌细胞凋亡。.4.本研究优化了人源结直肠癌异种移植瘤模型的建立，有效简化建模流程，缩短建模时间，建模成功率高，在肿瘤形态学和组织学特征上保持稳定。