PPAR/LXR通过介导脂质代谢网络通路调控牛肉品质的分子机制研究

The beef with low cholesterol, low fat and high unsaturated fatty acid has become more and more popular in consumers. We found that bovine PPARγ, LXRα, PPARα and SREBP2 gene are the most important functional genes in lipid metabolic network pathway and their mutations progress in our former study. Therefore, this study intends to analyze the law of beef quality formation and high-grade beef fat distribution in five different growth and development periods of Qinchuan cattle at population level. At individual and cell level, we apply isotopic tracer technique to analyze the fat distribution law in different carcass cuts and lipid metabolic law. At the same time, we screen high-expressed genes in lipid metabolic network pathway. On that basis, we carry out PPARγ, LXRα, PPARα and SREBP2 gene silence in cholesterol efflux, cholesterol synthesis and triglycerides synthesis metabolic pathway. Then, we study the interaction effect of functional genes in lipid metabolic network pathway and the molecular regulatory mechanism of beef quality. Furthermore, we screen and identify functional SNPs of PPARγ, LXRα, PPARα and SREBP2 gene using MALDI-TOF mass spectrometry technology. After association analysis between functional SNPs and meat quality traits, we apply eukaryotic expression analysis method, allele's specific report gene transfection technology and SiRNA interference methods to study the specific regulation function of functional SNPs. Thus, we verify regulation mechanism of functional genes through functional SNPs. The results will lay the foundation for beef quality formation mechanism in protein level, and offer basis for Qinchuan cattle's early selecting and the high quality beef cattle oriented cultivation.

低胆固醇、低脂肪、高不饱和脂肪酸牛肉越来越受到消费者的青睐。项目组在前期研究脂质代谢网络通路功能基因及其突变过程中，发现牛PPARγ、LXRα、PPARα和SREBP2的功能最为重要。本研究拟在群体水平分析秦川牛五个生长发育时期牛肉品质形成及高档牛肉脂肪分布规律；在个体、细胞水平，采用同位素示踪分析牛不同部位脂肪分布及脂质代谢规律，并筛选出脂质代谢通路中高表达基因。在此基础上，开展胆固醇排出、胆固醇合成和甘油三脂合成通路中上述4个基因的沉默，研究通路中基因的互作效应及调控牛肉品质的分子机制。继而，应用MALDI-TOF质谱筛查4个基因的功能SNPs，通过与肉质性状关联分析，采用真核表达、等位基因特异性报告基因转染和SiRNA干扰方法，解析功能SNPs的特异性调控作用，从而验证功能基因的调控机制。研究结果将为从蛋白水平研究牛肉品质形成机制奠定基础，为秦川牛早期选种和优质肉牛定向培育提供依据。

项目组围绕细胞水平研究脂质代谢网络通路中胆固醇排出代谢基因调控牛肉品质的机制开展研究。从新生牛肌肉中分离肌肉卫星细胞，并培养；探索在细胞中添加胆固醇的MTT试验，检测细胞内脂质指标，并从细胞中提取RNA，分析相关基因的表达情况及其分子生物学特征；采用RNA干扰技术，对核心关键基因进行沉默，筛选比较合适的转染病毒载体及其滴度，分析胆固醇排出代谢中关键基因的表达情况及其互作效应。.经过项目组人员精心努力，取得了以下阶段性成果：熟化了牛肌肉卫星细胞的分离培养工作，可以分离出较好的细胞用于后续研究；明确了胆固醇标品处理牛肌肉卫星细胞的浓度为5-10μg/mL，明确了不同处理时间和浓度对细胞内脂质的影响；概括出了甘油三酯 、胆固醇合成、胆固醇排出等脂质代谢的网络通路，明确了牛肌肉卫星细胞中六个较高表达的影响胆固醇排出的基因；明确了牛LXRa、PPARα、PPARγ、ABCA1、ApoE、RXRα基因的生物信息学特征；设计牛LXRa的干扰序列，经过连接、转化、重组和测序验证，成功构建了牛LXRa的干扰载体；对比了腺病毒、慢病毒载体侵染牛肌肉卫星细胞的效果，弃掉了腺病毒侵染的方法，筛选出了慢病毒侵染方法且最佳滴度MOI为300；成功组建包装了牛LXRa基因的慢病毒载体，并转染293T细胞，筛选出了四个不同病毒滴度的载体；慢病毒侵染牛肌肉卫星细胞，定量PCR筛选了最佳的干扰载体，干扰效率为88%，初步明确了胆固醇排出代谢通路中各关键功能基因的互作效应。.经过一年的项目研究，在《Gene》上发表SCI论文1篇，在《食品安全质量检测学报》上发表论文1篇；参与在中国农业出版社出版的《高档牛肉生产技术手册》；第二名完成的“优质高档牛肉生产关键技术研究与示范” 科技成果，经鉴定居国际先进水平；参加第二届中国食品科学青年论坛等国内学术会议，并作了大会报告；培养硕士研究生3名。.因此，本项目严格按照计划任务执行，根据研究进展的现实情况对具体的操作步骤进行了一些调整和变动，基本上完成了项目的预期目标。在牛的细胞选择上，将牛脂肪细胞改为牛肌肉卫星细胞，而牛肌肉卫星细胞更适合牛肉品质的研究；将需要干扰的牛PPARγ基因修改为牛LXRa基因，因为在试验过程中发现牛肌肉卫星细胞中牛LXRa基因的表达量更高一些。这些研究结果为应用核受体介导脂质代谢通路调控牛肉品质的机制奠定了最坚实的基础。