榨菜雄性不育新基因T的作用机制及其在大白菜雄性不育系创造中的应用

从榨菜（Brassica juncea Coss.var. tumida Tsen et Lee）胞质雄性不育系（CMS）中克隆了CMS相关基因T, 该基因可通过选择性剪接（AS）产生T1170和T1243两个转录本，后者包含一个Ⅱ型内含子TinⅡ。试验证实：T1243过表达可导致拟南芥雄性不育表型出现； T基因自身启动子启动的T1170和T1243过表达转化株中，重要的花发育调控转录因子AP3和PI与启动子的结合能力差异明显；TinⅡ内含子可编码一个小分子RNA。理论方面我们希望探明T基因的表达调控机制，包括ABC模型所涉及的转录因子与雄性不育的关系；microRNA影响T基因行使功能的方式；希望从一个崭新角度揭示植物CMS、microRNA以及AS等现象的有机联系。实践方面，开展CMS新基因T1243遗传转化创造大白菜（同属于十字花科）新型雄性不育系的工作，为育种实践工作奠定基础。

从茎瘤芥(Brassica juncea var. tumida)胞质雄性不育系(cytoplasmic male sterility, CMS)线粒体中克隆的T基因是一个CMS相关基因, 它能够通过选择性剪切产生T1170和T1243两个转录本, 而T1243是T基因在转录过程中保留了内含子TinII的产物. 我们之前的实验表明, 在模式植物拟南芥中过表达T1243(OE-T1243)后, 植株表现出明显的雄性不育表型, 而OE-T1170植株的表型与野生型无异. 然而这一现象的机制却知之甚少. 我们通过花药石蜡切片进一步确认了OE-T1243植株异于OE-T1170植株的花粉败育表型. 对15个已知花药发育相关基因的表达分析表明, 与OE-T1170或WT相比, OE-T1243植株中nozzle/sporocyteless, barely any meristem 1和2发生了不同程度的表达下调. 为了进一步研究TinII内含子的潜在功能, 将其构建于(−60)35S基本启动子区域上游, 来测试对下游GUS (β-glucuronidase) 基因的启动效果. 对转化植株的分析表明, TinI具有增强子功能, 它可以显著增强GUS基因的表达. 这表明TinII内含子能够作为一个增强子影响CMS相关基因T的功能. 以山西地区广泛栽培的5个大白菜品种为材料，带柄子叶为外植体，通过正交设计试验研究了品种、NAA、6-BA、AgNO3等因素对大白菜离体再生的影响。结果显示：品种津育75在培养基MS + 2 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA + 7 mg/L AgNO3的条件下再生率最高，达76.92%。以大白菜带柄子叶为外植体，通过农杆菌介导法，优化大白菜的遗传转化体系，得出结论：津育75的最佳筛选培养基为MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA + 7.0 mg/L AgNO3 + 7.5 mg/L Kan + 200 mg/L Amp，外植体在黑暗条件下预培养2 d，然后用OD600=0.1菌液侵染2 min，共培养2 d时转化率最高，为35.48%。对抗性植株进行分子检测，表明T1243基因已整合到大白菜中，并可以正常表达。