急性胰腺炎凋亡相关miRNA及其靶基因的筛选、鉴定和调控机制研究

急性胰腺炎(AP)是严重危害人类健康的疾病，在AP过程中腺泡细胞凋亡具有保护作用，保护机制尚未明确。miRNA作为基因转录后表达调控因子，据预测miRNA调控近1/3的基因。寻找凋亡相关miRNA（AAmiRNA）及其靶基因可能是研究AP过程中凋亡保护机制及治疗的新突破口。我们前期研究发现miR-22和miR-135a可能参与AP腺泡细胞凋亡过程，生物信息学分析提示miR-22和miR-135a候选靶基因是凋亡相关基因。本项目体外实验通过模拟上调及下调AAmiRNA的表达，筛选、鉴定AP过程中腺泡细胞AAmiRNA及其靶基因；体外、体内实验研究AAmiRNA调控特异性靶基因过程中的信号通路及其分子机制。本项目首次从miRNA水平研究AP发病中腺泡细胞AAmiRNA 及其靶基因，阐明AAmiRNA在腺泡细胞凋亡过程中的调控作用，为防治AP提供新的治疗靶点。

摘要 目的：研究凋亡相关miRNA在大鼠急性胰腺炎中的表达，并对其靶基因进行筛选、鉴定及其调控机制进行研究。方法：50ng/ml TNF-α诱导大鼠胰腺外分泌细胞系(AR42J)建立体外急性水肿型胰腺炎模型，未处理的AR42J作为对照，实时定量RT-PCR检测凋亡相关miRNA的mRNA表达变化。慢病毒携带高表达凋亡相关miRNA的模拟物(AAmiRNA mimic)及反义寡核苷酸链(AAmiRNA AMO)转染AR42J,转染空病毒组做为对照，体外急性胰腺炎模型建立后，使用RT-PCR检测AAmiRNA及靶基因的mRNA表达量；并检测干预12h后培养基中淀粉酶、脂肪酶、乳酸脱氢酶含量，流式细胞术检测AR42J细胞凋亡率，Western Blot法检测活性caspase3表达。结果：TNF-α诱导AR42J建立的体外急性胰腺炎模型，miRNA29a、miRNA135a的mRNA水平较对照组明显升高(p<0.05)；携带AAmiRNA mimic及AAmiRNA AMO的慢病毒转染AR42J，急性水肿性胰腺炎模型建立后，转染AAmiRNA mimic组较对照病毒组miRNA29a和miRNA135a表达量明显升高（p<0.05），活性caspase3、TNFRSF1A（miRNA29a靶基因）表达量明显升高（p<0.05），Sp3（miRNA135a靶基因）表达量明显降低（p<0.05）,AR42J凋亡较对照组明显升高(p<0.05)；转染AAmiRNA AMO组，较对照病毒组，miRNA29a和miRNA135a表达量明显降低（p<0.05），活性caspase3、TNFRSF1A表达量明显降低（p<0.05），Sp3表达量明显升高（p<0.05），AR42J细胞凋亡明显降低（p<0.05）。结论：上调凋亡相关miRNA29a、miRNA135a的表达，下游靶基因表达明显升高，细胞凋亡率明显升高，可能会减轻急性胰腺炎的严重程度。