Nrf2在脓毒症急性肺损伤中的作用及其机制研究

The role of oxidative stress has been well appreciated in the development of sepsis-induced acute lung injury (ALI). The lung undergoes changes favoring adhesion and transmigration of PMNs, resulting in PMN accumulation in lung, which is a characteristic of sepsis-induced ALI.The balance of reactive oxygen species depends on the series of antioxidant enzymes. In the meantime, Nrf2 regulats the expression of most antioxidant enzymes. Recent studies have revealed that Nrf2 signaling pathway might be able to protect lung, but whether Nrf2 plays a role in acute lung injury are still unclear. We have successfully cloned full-length of rat Nrf2 gene, which can effectively filter out the interference of gene expression of Nrf2 siRNA. We also observed low express of Nrf2 in sepsis-induced ALI patients. On these basis, this project intends to isolate and culture human neutrophils which stimulated by LPS, establish murine model of LPS-induced acute lung injury. And then, we will observe changes of Nrf2, antioxidant enzymes and the oxidation products at different time points, and analysis Nrf2 transcriptional activity. We will also separate peripheral blood neutrophils of patients with sepsis-induced ALI to verify the function of Nrf2 signaling pathway in the development of sepsis-induced ALI. Through the implementation of this subject, we may be able to further elucidate the mechanism of ALI, and to provide experimental basis for future research and treatment.

中性粒细胞于肺内大量聚集并激活过量活性氧是导致急性肺损伤（ALI）的发病基础，其具体调控机制目前受到广泛关注。活性氧的平衡依赖于抗氧化酶，Nrf2调控大部分抗氧化酶的表达。研究表明，Nrf2表达增强具有肺保护作用，Nrf2在脓毒症ALI中的作用目前未知。在前期研究中，我们发现脓毒症ALI患者的Nrf2表达明显减弱。我们设想，脓毒症时Nrf2表达降低，导致其下游系列抗氧化酶转录合成减少，清除活性氧自由基能力下降，诱发了ALI的发生。本项目拟采用LPS诱导的大鼠ALI模型，并分别给予Nrf2抑制剂和激动剂，观察不同时间点Nrf2、抗氧化酶、氧化产物的变化，分析Nrf2在ALI发生发展的作用及其机制；体外分离、培养人中性粒细胞后用LPS刺激，并用SiRNA沉默Nrf2，观察Nrf2在ALI中的作用。通过本课题的实施，以期进一步阐明ALI的发生和调控机制并为ALI提供新的治疗干预靶点。

背景 中性粒细胞于肺内大量聚集并激活过量活性氧是导致ALI的发病基础，其具体调控机制目前受到广泛关注。活性氧的平衡依赖于抗氧化酶，Nrf2调控大部分抗氧化酶的表达。Nrf2在脓毒症ALI中的作用目前未知，在前期研究中，我们发现ALI患者的Nrf2表达明显减弱，我们设想，脓毒症时Nrf2表达降低，导致其下游系列抗氧化酶转录合成减少，清除活性氧自由基能力下降，诱发了ALI的发生。内容 通过CLP法建立大鼠脓毒症ALI模型，以Nrf-2激动剂SFN、抑制剂ATRA干预，测定Nrf-2转录、蛋白表达水平及SOD、HO-1、CAT转录水平，探索Nrf-2信号通路对大鼠脓毒症ALI的保护作用。方法 采用SPF级SD大鼠，随机分为SHAM组、CLP 组、CS组和CA组，各组按观察时点8h、16h、24h 及生存情况分析组分成四个亚组。SHAM组给予腹腔注射玉米油；CLP组注射等量玉米油，建立CLP模型；CS组和CA组在CLP建模前30min给予腹腔注射SFN、ATRA。各时间点处死大鼠后取双侧肺组织，左肺两叶测量其干湿比值（W/D)，右肺下叶部位进行HE染色及免疫组织化学检测，中叶组织以Western-Blot法检测Nrf-2蛋白水平，提取右肺上叶组织中总RNA，用RT-PCR法测Nrf-2、SOD1、HO-1、CAT mRNA水平。结果 CLP组与SHAM比较，肺组织出现不同程度损伤，W/D值升高，免疫组化示Nrf-2为中~强阳性表达，阳性系数升高，8h与16h时Nrf-2蛋白含量升高，而在24h时较下降，Nrf-2、SOD1 、CAT、HO-1mRNA表达在8h、16h升高，而在24h时下降；SFN组与CLP组相比，肺组织损伤程度减轻，W/D值减低，免疫组化见Nrf-2阳性系数高于CLP组，各点Nrf-2蛋白，Nrf-2、SOD1、CAT、HO-1mRNA表达升高；而CA组与CLP组相比，肺组织损伤程度加重，W/D值增加，免疫组化示Nrf-2阳性系数低于CLP组，8h、16h时Nrf-2蛋白低于CLP组，8h 时Nrf-2、SOD1、CAT mRNA表达下降，而各点HO-1 mRNA与CLP组无明显差异。结论 通过本课题的实施，我们发现Nrf-2激活可调控体内ARE依赖的抗氧化基因SOD、CAT、HO-1表达，发挥抗氧化效应，对大鼠脓毒症急性肺损伤具有保护作用。