人孤雌胚胎干细胞分化的肠上皮干细胞移植治疗炎症性肠病的潜能及其机制研究

Inflammatory bowel disease(IBD) includes Crohn's disease, ulcerative colitis, and so on. Prolonged course and serious complications are the features of IBD. IBD can cause severe disorder of digestion and absorption, and even endanger the lives of patients. It is a troublesome medical problem in clinic and there is no effective treatment at present. Stem cell transplantation offers new hope in treating IBD. Because human parthenogenetic embryonic stem cells(hPESCs) have multiple differentiation potential and the advantage of immunologic rejection and ethics, it is expected to become the significant cellular source in treating IBD. At present, there is few related reports about hPESCs derived cell used for treating IBD. Stepwise induced method will be adopted in this study. Firstly, hPESCs will be induced to differentiate into definitive endoderm(DE) by Activin A and Wnt3a. Secondly, DE will be induced to differentiate into intestinal epithelial stem cells(IESCs) by EGF. Then the capability to differentiate into intestinal epithelium of the IESCs and its potential mechanism will be further explored by induction in vitro and in vivo. Subsequently，IESCs will be transplanted to the animal model with impaired intestinal epithelium to explore the potential and mechanism of IESCs in colonization and repairing damage of intestinal epithelium in vivo. It will restore the intestinal function of the patient with IBD and provide novel idea，theoretical and experimental basis for stem cell transplantation in treating IBD in clinic.

炎症性肠病(IBD)包括克罗恩病和溃疡性结肠炎等，病程迁延，并发症严重，可引起严重的消化吸收障碍，甚至危及患者生命，是当今临床治疗上的一个重大医学难题，目前仍缺乏有效的治疗方法。干细胞移植是治疗IBD的新希望，人孤雌胚胎干细胞(hPESC)具有多向分化潜能，在免疫排斥和伦理学方面具有优势，有望成为治疗IBD的细胞来源，目前国内外相关报道甚少。本项目拟采用分阶段诱导分化法，先联合应用Activin A和Wnt3a诱导hPESC向限定性内胚层(DE)分化，再用EGF诱导DE向肠上皮干细胞(IESC)分化；分别在体内、外诱导IESC向肠上皮细胞分化，探讨其分化为肠上皮细胞的能力和机制；接着将IESC移植于肠损伤模型小鼠体内，旨在研究其在小鼠体内的定植和修复肠上皮的能力及机制。这将有助于改善IBD患者的肠道功能，为临床开展干细胞移植治疗IBD及肠组织器官工程开拓新的思路，并提供理论和实验依据。

研究背景：炎症性肠病(IBD)包括克罗恩病和溃疡性结肠炎等，病程迁延，并发症严重，可引起严重的消化吸收障碍，甚至危及患者生命，是当今临床治疗上的一个重大医学难题，目前仍缺乏有效的治疗方法。干细胞移植是治疗IBD的新希望，人孤雌胚胎干细胞(hPESC)具有多向分化潜能，在免疫排斥和伦理学方面具有优势，有望成为治疗IBD的细胞来源。.研究内容：①hPESC体外培养体系的优化：分别在hPESC-MEF饲养层培养体系、hPESC- hFF饲养层培养体系和hPESC-无饲养层培养体系下体外培养hPESC，筛选出hPESC的最佳培养体系。②hPESC向限定性内胚层（DE）的定向分化：联合Activin A和Wnt3a诱导hPESC向DE分化，通过RT-PCR技术和流式细胞术检测DE标记物(CXCR4、ECD、Sox-17、Gsc等)的表达情况，确定hPESC向DE分化的准确时间窗。③DE向肠上皮干细胞（IESC）的定向分化：EGF诱导DE向IESC分化，通过实时定量PCR和免疫细胞化学双染色技术检测IESC标记物(Msi1、Hes1等)的表达情况，确定DE向IESC分化的准确时间窗。④体内分化实验：IESC移植至裸鼠皮下组织，将形成的移植瘤分别进行组织病理学检测和肠上皮细胞标记物检测（RNA水平和蛋白水平），检测IESC分化为肠上皮的能力。⑤hPESC分化为IESC、IESC分化为肠上皮细胞的机制研究：通过免疫组化和实时定量PCR技术研究多种信号通路和基因家族在IESC分化为肠上皮细胞中的作用及它们之间相互联系、相互影响、共同作用的网络调控机制。.研究结果：①建立适于hPESC体外长期培养并维持干性的最佳培养体系。② Activin A和Wnt3a联合成功诱导hPESCs分化DE。③ EGF成功诱导DE分化为IESCs。④ IESCs在小鼠体内成功分化为肠上皮细胞。⑤ Wnt信号通路中的Gsk-3β可以磷酸化Notch通路中的Notch受体的中的胞内结构域，使得Notch通路的下游基因Hes1的活化及表达增多。.科学意义：探讨hPESCs分阶段分化为肠上皮细胞的能力和机制；研究IESCs在小鼠体内的定植和修复肠上皮的能力及机制。这将有助于改善IBD患者的肠道功能，为临床开展干细胞移植治疗IBD及肠组织器官工程开拓新的思路，并提供理论和实验依据。