家蚕油蚕突变体显性短节油蚕Obs的定位克隆研究

The larval skin of the silkworm, Bombyx mori is generally white and non-translucent because of the deposition of uric acid crystals in epidermal cells. In some strains, the larval integuments accumulate little uric acid because of genetic defects and appear transparent. Because they resemble oiled paper, they have been named “oily” silkworms. More than 30 oily mutants of the silkworm have been reported. Because of the special physiological characteristics and rich resources, the cloning and researches about related signal transduction pathway of oily genes would help us understand uric acid metabolism in the silkworm and other organisms, and provide new ideas to treat diseases related to uric acid metabolism. In this study, we will isolate and identify the responsible gene for the Obs mutant “Dominant obese translucent”, a dominant oily mutant by positional cloning and the Bombyx draft genome sequence. The Obs mutant not only exhibits an abnormally reduce accumulation of uric acid but also shows an abnormal body shape, and pigmentation. Although some studies on uric acid metabolism, body shape determination, and pigment formation in insects have been reported, the association between these three systems is unknown. Therefore, the analysis of the Obs mutant will shed light on mechanisms of uric acid accumulation, body shape determination, and pigment formation in insects.

家蚕幼虫表皮一般含有大量的尿酸盐结晶，使其表皮呈现白色或者不透明。有些品种由于表皮细胞中尿酸盐的含量不足或者没有，整个体壁看起来半透明或透明，如同一层油纸，称为油蚕。油蚕突变体是由于尿酸代谢异常引起的，至今已发现有30多种油蚕。由于其特殊的生理特征和丰富的突变资源，开展油蚕突变基因定位克隆及相关信号传导通路研究，对于揭示尿酸盐代谢机制，以及寻找尿酸盐代谢疾病的药物靶标具有重要的参考价值。本研究拟根据家蚕定位克隆配置材料的通用策略，配置Obs与野生型品种p50T的回交群体，将其和亲本作为连锁分析样本；筛选PCR差异多肽和SNP markers；建立Obs连锁区域；分离克隆Obs并对其进行功能研究；另外对Obs进行转录组测序，分析Obs的突变对其他基因表达的影响，探明该基因在尿酸代谢、体型决定和色素形成机制中的作用。

家蚕幼虫体壁一般含有大量的尿酸盐结晶，使其呈现白色或者不透明。有些突变品系由于表皮细胞中尿酸盐的含量不足或者没有，整个体壁看起来半透明或透明，如同一层油纸，称为油蚕。油蚕突变体是由于尿酸代谢异常引起的，至今已发现有30多种油蚕。由于其特殊的生理特征和丰富的突变资源，开展油蚕突变基因定位克隆及相关信号传导通路研究，对于揭示尿酸盐代谢机制，以及寻找尿酸盐代谢疾病的药物靶标具有重要的参考价值。显性短节油蚕（Obs）是油蚕突变品系的一种，不仅表现了油的表型而且身体短胖，另外体表的颜色呈现异常。Obs是单基因引起的显性突变体，经典遗传学连锁图谱已经将其基因定位在18号染色体6.2cM座位，到目前为止Obs突变基因还未被克隆。本研究通过定位克隆将Obs的突变基因定位在了18号染色体nscaf 2901上大约224kb的区间，该区间有12个预测基因。5龄3天Obs突变型和正常型家蚕体壁转录组数据的FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）值分析发现只有编号为BGIBMGA008255的基因在正常品系和Obs之间有显著表达量差异。对该基因进行测序发现，其编码蛋白N端的信号肽有8个氨基酸在Obs中缺失。体壁的免疫荧光定位实验发现，BGIBMGA008255编码的蛋白在Obs中有一部分在表皮细胞中积累，没有分泌到表皮层中。为了阐述Obs的突变机制和产生表型多样性的原因，本项目选取了5龄3天Obs突变型和正常型家蚕的体壁进行了LC-Ms/Ms分析，共鉴定到244个显著差异表达的蛋白。其中33个仅在正常型中检测到，117个仅在Obs中检测到，41个在Obs中下调表达，53个在Obs中上调表达。在这些显著发生变化的蛋白中26个是表皮蛋白，它们的蛋白丰度占总的显著差异蛋白丰度的84%。另外对Obs表型相关的蛋白通路进行了分析。最后发现Obs突变体的多表型是由于BGIBMGA008255编码的表皮蛋白信号肽缺失，引起该表皮蛋白在表皮细胞中大量积累，造成表皮细胞内环境破坏，最后导致一些和尿酸积累，色素形成以及表皮形成的蛋白发生异常引起的。本项目的研究结果对于进一步理解表皮形成、表皮色素沉着以及昆虫体型决定有重要参考价值。