胚特异表达花青素作为直观标记在花粉介导的玉米转基因中的应用

The most extensively-used plant genetic transformation methods ，Agrobacterium tumeficiens-mediated and biolistic bombardment transformation, have the following disadvantages: they employ the tissue culture process, thus are time-consuming, low efficiency and genotype-dependent; to select transformants they use antibiotic or herbicide resistance selectable marker genes, which are controversial in the sense of safety; and the patents belong to foreign companies. Therefore, this study intends to construct expression vectors containing anthocyanin regulators driven by embryo-specific promoters. Then, maize is transformed with the constructed vectors using the pollen-mediated transformation approach. Thus, the transgenic seeds in the T0 and later generations can be visually identified by the color of the embryos. In this study, the anthocyanin pigment is specifically produced in transgenic maize embryo as a visible selectable marker. The transcription factors Lc/C1 and/or Bperu/C1, which control anthocyanin biosynthesis, are used. The genes encoding these factors are driven under the embryo-specific promoters for tissue- and development-specific expression. The candidate promoters include 9 of those from maize, rice，wheat, and barly,respectively. The development of the visual selection system for selecting transformants can circumvent most shortcomings of tissue culture methods, and will provide a system which can enhance the transformation efficiency, simplify the procedure and shorten the breeding cycle. This system can also be applied to other crops.

目前广泛使用的植物转基因方法农杆菌介导法和基因枪法具有以下缺点：必须通过组织培养过程，因而耗时长效率低，且有很大的基因型依赖性；为了获得转化植株必须使用有安全性争议的抗生素或除草剂抗性选择标记基因；发明专利均为国外公司注册。对此，本研究拟构建胚特异性表达的花青素基因载体作为转基因研究中转化子的直观选择标记，并将该载体用于花粉介导的玉米转基因研究中，从而可以直观地从转化当代及其后代种子中通过红/紫色胚筛选到转化籽粒。本项目拟用调控花青素合成的转录因子Lc/C1和/或Bperu/C1与多种胚特异性启动子构建表达载体并使其在玉米胚中表达。这些候选启动子包括9个分别来自于玉米、水稻、小麦和大麦的启动子。该直观选择转化子方法的建立能够避免通过组培转基因方法的许多不足之处，将会提供一种更加简便高效快速的植物转基因体系，而且该方法也可用于其它作物的转基因育种实践。

目前广泛应用的植物转基因方法农杆菌介导法和基因枪法具有以下缺点：必须通过植物组织培养过程，因而耗时长效率低，且有很大的基因型依赖性；为了获得转化植株通常使用有安全性争议的抗生素或除草剂抗性选择标记基因；发明专利均为国外公司所有。为避免以上缺点，本研究构建了新的胚特异性表达的花青素基因载体并将其作为花粉介导转基因方法中对转化子选择的直观标记，以便创新更加简便高效和拥有我国自主知识产权的植物转基因方法。. 本研究用花青素调控因子C1/Bperu分别与玉米胚特异性启动子GLB1和组成型启动子CaMV35S构建了两个转化载体，pGlb1CB和p35SCB，并利用基因枪转化方法，将重组表达载体转入玉米幼胚。显微观察结果证实，这两个新载体均能在玉米幼胚细胞中瞬时表达。同时我们还将该载体用于花粉介导的玉米转基因研究中,并获得了36粒颜色改变的疑似转化籽粒（疑似转化率为3.86%）。本研究还利用扫描电子显微镜和荧光显微镜对花粉介导植物转基因方法中的处理花粉进行了观察，为该方法提供了新的细胞学证据。用花青素作为标记基因与花粉介导法相结合，不仅可以减少公众对转基因生物安全性方面的担忧，而且可以直观地从转化当代和后代种子中通过颜色变化筛选到转化籽粒，避免了通过组织培养转基因方法的许多不足之处，从而可以大大简化筛选程序，加快转基因品种选育进程，提高工作效率和节约检测成本。这一非组培转化结合直观选择转化子方法的建立将会提供一种更加简便高效快速、无基因型依赖性和拥有我国自主知识产权的植物转基因体系，对于植物转基因研究和实际应用都具有十分重要的意义。