基于SPR的纳米荧光分子探针活细胞内肿瘤药敏基因的检测及其穿膜特性的研究

肿瘤个体化治疗是当今肿瘤治疗发展的必然趋势，也是提高恶性肿瘤治愈率的有效途径。对肿瘤患者相关药敏基因的检测将极大地帮助临床医生制定个体化用药方案。而目前基因检测的普遍方法PCR技术、基因芯片等都不能进行活体组织或活细胞内多种基因的同时检测，在实时监测药物对肿瘤细胞的基因调控等动力学过程中受到限制。本申请课题拟充分利用纳米金的表面等离子效应及荧光量子点优异的光学特性，构建基于纳米金-荧光量子点的特异性寡核苷酸纳米分子信标，实现肿瘤组织或活细胞内多种药敏基因mRNA的同时监测，为临床个体化用药提供最根本的生物信息学数据。通过优化纳米粒子的粒径、受体-供体的距离、表面修饰、特异性杂交序列等，提高分子探针的检测灵敏度及特异性。进一步研究该荧光纳米探针的组织穿透能力及细胞穿膜特性，建立药敏基因在位监测技术平台，必将推动肿瘤化疗个体化用药的快速发展。

当今世界，恶性肿瘤依旧是威胁人类健康及生命的重要杀手。而化学治疗作为一种主要的肿瘤治疗手段，已逐渐从非特异性治疗转向分子靶向治疗。但由于肿瘤本身特性，即便是同一种癌瘤的患者对同一种化疗方案，其对治疗药物的敏感性以及预后也显著不同，因此，预测化疗药物的敏感性是提高肿瘤治愈率、实现个体化用药的有效方法，也是当前肿瘤治疗发展的必然趋势。由于肿瘤异质性包括肿瘤结构功能的异质性和发生发展异质性，药物敏感相关基因的检测已势在必行。大多数常规的基因检测技术如分子印迹杂交技术、荧光原位杂交技术、荧光 PCR技术、基因芯片技术等不能进行生物组织或活细胞内基因的直接检测, 因而在研究活细胞基因表达调控、药物响应等动态基因检测领域受到了限制。荧光共振能量转移为我们开发分子信标提供了原理。金纳米粒子作为无机纳米材料因其安全无毒，吸收光子效果好成为了受体的优先选择。本项目成功合成了以金纳米为猝灭基团、FITC为荧光基团的发夹型分子信标，并对其结构进行PEG修饰以及序列数目的优化，以提高其生物相容性和稳定性；同时通过调节超声（功率、超声时间、占空比及细胞孵育时间）至最佳参数，上调清道夫受体的表达以及穿膜肽的修饰提高分子信标的穿膜效率，从而提高了检测的灵敏度。本项目在优化好的参数的基础上，选择影响抗肿瘤药物阿霉素响应的基因 MDR1 设计特异性杂交序列，成功用于肿瘤活细胞中MDR1 mRNA的检测。可依据活细胞内杂交信号的强度，评估各肿瘤细胞对阿霉素的响应，有助于实现个体化给药。本项目构建了相关肿瘤模型，成功运用金纳米粒优越的光学特性，设计一系列基于纳米金的特异性核苷酸分子信标，实现活细胞内信号转导和转录因子（STAT5B）、跨膜丝氨酸蛋白酶Matriptase、雷帕霉素靶蛋白mTOR、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 Akt以及药敏基因MDR1的在位实时动态同时检测，为肿瘤的早期诊断以及化疗药物敏感性的预测提供依据，促进了肿瘤监测及靶向治疗的的发展。