井冈霉素生物合成温度调控机理解析及其模块利用

Validamycin A (abbreviated as VAL-A) has been an important antifungal agent against rice sheath blight disease and is produced by Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis 5008. Previous investigation revealed that the biosynthesis of VAL-A is thermo-regulated in S. hygroscopicus 5008, and the mechanism remains unknown. A regulatory gene SHJG0322 was previously found to be positively involved in the thermo-regulation of VAL-A biosynthesis. Herein, key regulatory genes acting upstream and downstream of SHJG0322 will be identified using comparative transcriptomes, gene knockout and electrophoretic mobility shift assay. Furthermore, immediate transcriptional regulatory proteins bound to the valK-valA-int promoter region will be obtained through DNA-affinity chromatography coupled with Mass spectrometry. Finally, based on the thermo-regulatory mechanism of VAL-A biosynthesis, the thermos-regulatory module will be completely reconstituted, optimized, and applied for an engineered thermo-regulated production of other natural products using actinorhodin as a model.

井冈霉素是防治水稻纹枯病的重要农用抗生素，主要由吸水链霉菌5008产生。前期研究发现，井冈霉素的生物合成具有独特的温度调控现象，在37 °C以上时大量产生，但是其温度调控机理尚未深入解析。此前，通过比较不同温度条件下吸水链霉菌5008的差异转录组，发现正调控因子SHJG0322参与了井冈霉素生物合成的温度调控。本项目在此基础上，首先拟基于差异转录组，结合基因敲除与凝胶阻滞等实验方法，鉴定温度调控基因SHJG0322的上下游关键调控基因。其次，通过DNA亲和层析等实验，筛选与鉴定不同温度条件下与井冈霉素基因簇启动子区域结合的调控蛋白。基于以上体内体外的实验结果，彻底解析井冈霉素生物合成的温度调控机理。最后，根据温度调控机理中的级联调控关系，重构和优化完整的温度响应模块，并利用该模块实现放线紫红素等生物合成基因簇的异源温控表达。

抗真菌井冈霉素的生物合成过程具有独特的高温调控，在37度以上显著表达并高产。为了揭示其高温调控机制并构建和利用高温调控模块，本项目拟一方面针对挖掘井冈霉素生物合成的关键温度调控因子，解析其温度调控机理，另一方面拟异源重构井冈霉素生物合成的温度响应模块，实现放线紫红素的异源温控表达。按照研究计划，一方面我们筛选获得了与温度调控密切相关的顺式作用启动子元件和反式作用调控蛋白元件，明确了其与井冈霉素生物合成的相关性，并首次鉴定了温度调控的高GC含量特征序列；另一方面，在白色链霉菌J1074中建立了由温敏启动子和正调控蛋白组成的调控模块，实现了黑色素的异源高效合成，为其他天然产物的温控异源高效合成奠定了基础。此外，我们还揭示了井冈霉素的生物合成新机制，获得了井冈霉素新结构衍生物，为井冈霉素的进一步高产奠定了坚实基础。本项目目前发表了2篇SCI研究论文、申请了3项专利、培养了1名博士后、1名博士和2名硕士。相关的其他3篇论文正在整理和投稿之中。