具有蒜氨酸酶活性和肿瘤靶向的骆驼单域抗体的构建及其抗肿瘤作用

近年来发现骆驼科动物中存在一种缺失轻链但具有完整功能的天然重链抗体，其抗原识别区也被称为单域抗体，可以优先结合酶的活性中心。根据这个特性，本研究以蒜氨酸酶为抗原，采用骆驼单域抗体噬菌体展示技术，筛选具有蒜氨酸酶活性的抗独特型骆驼单域抗体，并与整合素αvβ3的配体RGD序列进行融合，获得具有蒜氨酸酶活性和肿瘤靶向作用的单域抗体。同时，建立基于抗体酶靶向和催化双重作用的肿瘤前药治疗方法，利用大蒜中蒜素的前体物质蒜氨酸，在肿瘤细胞表面经抗体酶转化为大蒜素，在体内产生有效的肿瘤抑制作用。研究主要包括：1.骆驼抗独特型单域抗体作为抗体酶筛选平台的研究；2.具有肿瘤靶向性和蒜氨酸酶活性的单域抗体的制备；3.单域抗体的体内外抗肿瘤作用。本研究提出的抗独特型骆驼单域抗体技术，为抗体酶的制备提供了新的方法，同时为大蒜素在体内发挥有效的抗肿瘤作用提供借鉴。

本项目圆满完成了项目计划的三个主要内容：（1）建立了骆驼抗独特型抗体的抗体酶筛选平台；提出了一种新的基于骆驼单域抗体的抗体酶制备方法（2）获得了一株具有蒜氨酸酶活性的骆驼单域抗体VHHC10，并制备得到了具有肿瘤靶向性和蒜氨酸酶活性的单域抗体VHHC10-RGD；（3）初步验证了该单域抗体酶作为肿瘤前药治疗导向药物的可行性，为今后该抗体酶的应用提供了基础。骆驼单域抗体具有独特的抗原结合特性，包括作为酶的抑制剂、结合隐蔽抗原等常规抗体没有的特性，但其能否作为抗体酶模拟酶的活性未见报道。本项目基于此设想，开展具有蒜氨酸酶活性的抗体酶的制备和应用研究。基于纳米抗体的分子模拟特性，本项目采用抗独特型骆驼单域抗体模拟蒜氨酸酶的活性，从骆驼单域抗体噬菌体展示文库中经过两次独立的筛选，分别获得了具有蒜氨酸酶抑制活性的单域抗体VHHA4和具有蒜氨酸酶活性的单域抗体VHHC10。这是具有酶活性的骆驼单域抗体的首次报道，同时也提供了制备抗体酶的一种新的方法。在获得具有蒜氨酸酶活性的抗体酶的基础上，本项目进一步探讨了该抗体酶在肿瘤前药治疗中的应用价值。首先在抗体酶VHHC10中融合了整合素αV/β3的配体RGD序列，作为肿瘤靶向元件。流式细胞术检测证明融合RGD表达的抗体酶可以特异结合整合素αV/β3高表达的肿瘤细胞MDA-MB-231和B16F10。MTT和小鼠肿瘤体内实验表明，该融合抗体在体内外蒜氨酸底物存在的情况下，均可以显著抑制B16F10小鼠肿瘤的生长，具有潜在的治疗价值。