叶酸在植物组织和亚细胞器间转运机制的解析

As an indispensable vitamin, folic acid plays an important role in the growth, development and metabolism of animals and plants. Recent research showed that the defects of folate biosynthesis and metabolism resulted in multiple deficiencies in plant growth and development, but the molecular mechanism or the targets of folate during these biological processes have yet been understood. To investigate the mechanism of folate transport, here a chemical proteomics approach is going to be used to explore the global folate-dependent enzymes or proteins in plants. Combined with the chemical probes of folate, quantitative proteomics and functional validation we are trying to profiling the unknow transporter of folate. The aims of this study are to build up a platform to screen the target of functional small molecules rapidly in plant cells.

叶酸作为不可或缺的一种功能维生素，在动植物的的生长、发育、代谢等生命活动中有着极其重要的功能。叶酸具有调控多种植物生理功能的作用，而这其中的分子功能机制还不甚清楚。叶酸是如何在植物体内不同组织器官和亚细胞结构中的分布、转运并保持稳态等方面的深层机制还未得到明确的解析。为更好地解析叶酸在植物组织和亚细胞间的转运机制，本申请在前期利用化学蛋白质组学技术解析天然小分子化合物在动植物中的作用靶点的基础上，设计并合成有活性的叶酸骨架分子探针，通过植物体内喂养及标记，结合定量蛋白质组学技术，快速分析筛选可能的叶酸结合蛋白，从中筛选出尚未发现的具有叶酸转运功能的蛋白。结合体外和体内功能验证，解析叶酸在植物细胞内的转运机制。研究叶酸的生理作用不仅会加深我们对叶酸在植物中的功能的理解，同时也能以此为模型，建立快速准确鉴定小分子在植物体内行使活性功能的分子机制新方法平台。

叶酸（folates）包括四氢叶酸及其衍生物，属于水溶性B族维生素（B9），是所有生物体维持正常生命活动的重要功能因子。叶酸缺乏和叶酸稳态变化会严重影响植物胚胎发育、幼苗生长、开花、结实等过程，但有关叶酸如何参与这些生物学过程的研究还很少，对植物中的叶酸互作蛋白（FBPs）也尚未鉴定。.本研究利用基于亲和性的化学蛋白质组学技术，将植物体内具有生理活性的5-甲酰四氢叶酸（5-F-THF）与双吖丙啶（diazirine）和炔基基团（alkyne）连接的光亲和标签（Dayne）共价偶联形成在植物体内稳定存在的光亲和探针。我们发现该探针被拟南芥幼苗吸收、代谢和利用后任能保持生物学活性和稳定性。通过喂养探针，光诱导共价交联与探针的结合的蛋白，利用点击化学（click chemistry）技术交联生物素并亲和富集被共价交联的相应蛋白，并通过蛋白质组学鉴定可能的叶酸结合蛋白。经鉴定，我们共得到51个可能的叶酸互作蛋白，并通过蛋白-叶酸互作实验(Thermo shift assay; Microscale thermophoresis，MST)从中筛选出16个高亲和力互作蛋白和14个低亲和力互作蛋白。生化分析与功能预测显示，叶酸分子通过与这些蛋白的互作将一碳代谢、碳代谢和氮代谢三条代谢途径联结在一起。进一步研究还分析了2个高亲和互作蛋白二氢叶酸还原酶/胸苷酸合成酶(AtDHFR-TS1)和谷氨酰胺合成酶1;4(AtGLN1;4)与叶酸分子结合的位点及酶活变化。上述结果从蛋白组学角度开拓了对叶酸生物学功能的认识，为深入探索叶酸在植物发育中的作用机理奠定基础。