基于结构DNA纳米材料的生物单分子荧光成像技术研究

本项目拟以结构DNA纳米技术和荧光显微技术为研究技术平台，利用DNA易修饰、可人工合成、结构刚柔相济和生物相容性好等特点，设计组装二维和三维不同形状和空间结构的新型功能化结构DNA纳米材料，分别用于构建 1. 结构有序、结合位点间距可控、固定取向一致、结合密度均匀、且能保持生物大分子的生物活性的固相载体；2. 组装具有荧光量子产率高、光稳定性好、与生物大分子偶联形成的结合物稳定、结合的专属性比较强、对被标记物的理化性质，尤其是生物活性影响较小的新型三维DNA自组装荧光探针；3. 利用组装合成的固相载体和荧光探针结合荧光显微成像技术构建单个生物大分子荧光检测技术平台，实现对单个生物大分子高灵敏、高选择性、简便快速的单重和多重检测；4. 尝试将该技术用于血清中和癌细胞中生物大分子的检测，以期为实际生物样品和活细胞中生物大分子的实时监测提供技术支持。

结构DNA纳米材料通过碱基配对程序化组装功能性纳米结构，为分析化学提供有力的工具。单分子检测是在单个分子水平上获取信息的研究手段，灵敏度高。荧光成像技术获得的实验参数丰富，检测结果直观。本项目基于结构DNA纳米材料，进行生物单分子荧光成像技术与拓展性研究。工作包括以下几部分。（1）基于DNA四面体修饰基底的单分子检测技术定量检测DNA。基底表面修饰DNA四面体后，能降低非特异性吸附，提高检测效率。该DNA四面体修饰基底捕获目标核酸，与生物素化的检测DNA共同形成DNA四面体-目标核酸-检测DNA的夹心结构。夹心结构结合链霉亲和素包被的量子点，通过落射荧光显微镜成像。检测限为1.0×10-15 mol/L，较固定单链DNA的方法更低。DNA四面体修饰基底具有抵抗蛋白吸附的能力，能更好地实现血清中单分子检测。（2）基于DNA四面体的荧光纳米探针单分子定量检测蛋白质。DNA四面体荧光纳米探针能防止染料自猝灭，提高荧光强度和光稳定性。蛋白被基底捕获后，链霉亲和素化的抗体与蛋白通过免疫反应特异性结合，进而结合生物素化DNA四面体荧光纳米探针，通过落射荧光显微镜成像。该方法的线性范围跨越两个数量级，检测限为3.0 × 10-14 mol L-1，同时具有高特异性和低基质效应。（3）基于DNA信号放大技术灵敏检测生物分子，包括磁性纳米颗粒结合滚环扩增（RCA）反应构建免疫分析新方法用于蛋白质定量检测、基于哑铃型探针介导RCA的级联放大策略用于小分子检测等。（4）DNA与目标分子间相互作用研究与检测应用，包括Ag+稳定的DNA三螺旋探针设计与在转录因子检测中的应用等。本项目构建了非特异性吸附小、检测效率高的DNA四面体修饰基底与荧光强度强、光稳定性好的荧光纳米探针，其有望在生物成像中得到进一步应用。本课题的成果是对生物单分子荧光成像技术的丰富和扩展，将为生物分析和临床诊断中超低浓度的生物分子检测提供直观可靠的定量方法和研究工具。