固氮基因表达调控的生化基础研究

s54-RNA聚合酶调控的基因多数有着独特的生理功能，与生物固氮、环境、人类健康等息息相关。本研究着重于与固氮基因表达调控密切相关的s54-RNA聚合酶激活复合体的组装机制及其结构与功能研究。最新研究表明，s54-RNA聚合酶的转录需要具ATP水解活性的AAA+家族蛋白的特异性激活，同时激活蛋白与s54-RNA聚合酶的相互作用可以由DNA环化结构来促进，而此DNA环化结构一般由蛋白介导的DNA弯曲来稳定。本研究拟从s54-RNA聚合酶、AAA+家族激活蛋白、DNA弯曲蛋白及其靶位点这些主要元件出发，通过构建一系列突变体，测定它们的体内转录活性和体外各项生化、物理指标，揭示s54-RNA聚合酶激活复合体的组装机制及其结构与功能。本项目除包括基础分子生物学研究技术外，还将运用近年来迅速发展的冷冻电镜三维重构，荧光共振能量转移等新技术，为解析复杂蛋白DNA复合体提供了必要的研究手段。

本项目着重于与固氮基因表达调控密切相关的sigma54-RNA聚合酶激活复合体的组装机制及其结构与功能研究。最新研究表明，sigma54-RNA聚合酶的转录需要具ATP水解活性的AAA+家族蛋白的特异性激活，同时激活蛋白与sigma54-RNA聚合酶的相互作用可以由DNA环化结构来促进，而此DNA环化结构一般由蛋白介导的DNA弯曲来稳定。本研究从sigma54-RNA聚合酶、AAA+家族激活蛋白、DNA弯曲蛋白及其靶位点这些主要元件出发，通过构建一系列突变体，测定它们的体内转录活性和体外各项生化、物理指标，揭示sigma54-RNA聚合酶激活复合体的组装机制及其结构与功能。首先，我们发现DNA的物理特性参与基因表达调控。研究表明，IHF靶位点通过其自身的刚性阻碍DNA环化结构的形成，抑制增强子结合蛋白和sigma54-RNA聚合酶之间的相互作用，从而起到了类似真核中的insulator DNA的作用，对其深入研究必将扩展人们对于原核生物基因调控网络的认识。其次，我们构建了sigma54因子的突变体库，并在五个方面，对所有的突变体在体外进行了功能测试。最后，对AAA+家族激活蛋白的研究结果发现，AAA激活蛋白通过“分子瑜伽规则”完成其组装过程，对深入了解蛋白质非保守区，特别是不同功能区之间的铰链区的功能，揭示蛋白质组装机制对其功能的调节作用起到非常重要的理论指导作用；..此外，我们还对与固氮基因表达调控密切相关的，主管四碳二羧酸运输系统（dct）的二元调控系统的信号传导机理进行了比较深入的研究，取得了非常可喜的研究成果。发现通过配体结合，导致DctB膜外部分的二聚体界面上亮氨酸拉链打开，从而导致DctB膜内部分S-Helix铰链形成一种“打开的剪刀式”二聚体构象，进而导致整个DctB组氨酸激酶形成一种总体打开的二聚体构象。这些研究成果进一步揭示了与固氮相关的信号转导机制和基因表达调控机理，为提高生物固氮效率打下了坚实的理论基础。