凋亡相关新蛋白Pdcd2l在β细胞损伤中的功能和机制研究

Chronically elevated levels of fatty-acid in type 2 diabetes patient can result in not only insulin resistance in peripheral tissues but also pancreatic β cell failure. The transcription factor FoxO1 can determined the fate of β cells through regulating different target genes, and it has been reported to be involved in fatty acid-induced apoptosis in pancreatic beta cells. However, the molecular mechanism that involved still need to be explored. In previous study in our lab, we identified several direct targets of the transcription factor FoxO1 in the pancreatic beta cell line for the first time using the ChIP-DSL technology. And Pdcd2l, Nudt6 and Cdc9111, which related to cell proliferation, apoptosis and cell cycle control, were found to be regulated by FoxO1. Then we further confirmed the result by using the chIP-PCR assay, the result revealed that Pdcd2l was directly bound to FoxO1, and the binding was increased after palmitate incubation. We further found that the expression of Pdcd2l was dose- and time-dependent increased under palmitate treatment, furthermore, the luciferase assay showed that the activity of Pdcd2l promoter was time-dependent increased. More importantly, we also found that interference of Pdcd2l in INS-1 cells could protect cell apoptosis induced by palmitate. So in this study, we are plan to confirm the regulation of FoxO1 on Pdcd2l expression, identify the role of Pdcd2l in fatty acid induced β cell apoptosis and dysfunction, and try to demonstrate the molecular mechanism that might be involved. Our project will support a new potential target for the treatment of type 2 diabetes.

2型糖尿病病人体内长期高水平的脂肪酸是引起β细胞功能障碍和凋亡的主要原因之一。我们前期实验发现，与细胞周期、凋亡相关的新基因Pdcd2l受到FoxO1的调控，并且在棕榈酸引起的β细胞凋亡中有着重要作用。结果表明，棕榈酸处理后β细胞中Pdcd2l的基因和蛋白表达水平都明显升高，过表达Pdcd2l可以明显增强棕榈酸引起的β细胞凋亡，而干扰Pdcd2l可以显著逆转棕榈酸引起的凋亡。因此我们推测，Pdcd2l是FoxO1在β细胞中发挥负向调控作用的重要靶基因。然而目前为止，Pdcd2l在β细胞中具体的功能与作用机制仍不清楚。本项目拟借助于体外β细胞研究与2型糖尿病小鼠模型研究相结合，阐明Pdcd2l基因在棕榈酸诱导的β细胞损伤中的功能与分子机制。本项目的顺利完成将有助于进一步了解β细胞内FoxO1的调控机制和新蛋白pdcd2l的功能，从而为2型糖尿病中β细胞的保护提供新的靶基因。

胰岛β细胞是机体中唯一可以分泌胰岛素这一降糖激素来维持血糖稳定的细胞群，其功能的损伤或数量的减少都会导致糖尿病的发生。转录因子FoxOl是胰岛素信号通路中一个非常重要的调控因子。在不同的刺激条件下，FoxOl甚至可以表现出完全相反的作用，这可能是由于FoxOl激活后调控了不同的下游靶基因所致。然而，究竟有哪些下游基因参与介导了FoxOl对胰岛β细胞的多种调控机制，目前还知之甚少。本实验室的前期工作以棕榈酸诱导的胰岛β细胞损伤为模型，通过ChIP-DSL芯片的筛选发现，在棕榈酸引起的胰岛β细胞损伤过程中，多个基因的启动子区与FoxOl 的结合发生了改变，这些基因有可能是受到FoxOl调控的靶基因。本研究即基于该基础，着眼于胰岛β细胞的凋亡调控，筛选了其中与细胞的增殖、凋亡密切相关的基因Pdcd2l进行进一步的研究。对其研究发现，Pdcd2l基因的表达水平在棕榈酸刺激下呈浓度和时间依赖性的升高。荧光素酶实验显示，在棕榈酸处理后Pdcd2l基因启动子区的活性呈现时间依赖性的升高，这可能是导致其mRNA水平升高的原因。我们通过ChIP和EMSA实验确认，FoxOl与Pdcd21基因的启动子区都有结合，并且这一结合能力在棕榈酸刺激之后明显增强。过表达FoxOl可以导致Pdcd21基因启动子区活性的增强和mRNA表达水平的升高，而干扰FoxOl不仅可以明显降低Pdcd2l 在基础本底水平上的表达，更可以逆转由棕榈酸刺激引起的表达水平的升高。这些结果说明Pdcd2l的转录活性和表达水平受到转录因子FoxOl的调控，是FoxOl的下游靶基因。进一步过表达Pdcd2l可以增加由棕榈酸刺激所引起的胰岛β细胞凋亡，而将Pdcd2l的表达干扰之后则可以部分逆转这一凋亡现象，这一过程很可能是通过激活Caspase-3而实现的。.我们的研究首次发现Pdcd2l基因是受FoxOl调控的靶基因。棕榈酸通过FoxOl的介导引起Pdcd2l表达水平的升高，从而介导了棕榈酸诱导的胰岛β细胞的凋亡，Caspase-3的活化很可能参与了这一过程。本研究结果对FoxOl 介导脂肪酸引起胰岛β细胞凋亡的机制进行了深化和补充，有助于进一步阐明 2型糖尿病过程中胰岛β细胞数量调节的分子机制。