ENT1调控大鼠缺血再灌注后脑组织兴奋性氨基酸毒性的机制研究

Cerebralischemia reperfusion is closely related to the excitatory amino acid toxicity. Equilibrative nucleoside transporter-1 (ENT1) regulates the level of intracellular and extracellular inhibitory neurotransmitter adenosine due to changes of the micro environment. A lot of literature reveals the adenosine level is regulated by neuroglia interaction，and to adjust the adenosine level is effective for the level of excitatory amino acid, but its specific molecular signaling mechanism is not clear. Recent studies have shown that cAMP response element binding protein（CREB） is a downstream factor of ENT1. There is no literature about ENT1 mediated by CREB signaling pathway involves in the excitatory amino acid toxicity after cerebralischemia reperfusion. The project intends to build the ENT1 lentiviral plasmid to conduct function research by observing the rat electroencephalogram(EEG)，behavior, using patch clamp to monitor electrophysiological changes in the brain slice, and detecting related molecular expression in the neuronal cells by molecular biology technology. The CREB change will be observed by using ENT1 specific inhibitor, and the brain ENT1, pCREB and related protein expression will be compared between different groups. The applicant expect to reveal these mechanisms from the molecular signaling perspective, and provide a new target for the prevention and treatment of excitatory amino acid toxicity after cerebralischemia reperfusion.

脑缺血再灌注后损伤与兴奋性氨基酸毒性密切相关。1 型平衡型核苷转运体（ENT1）可因微环境的变化而调节细胞内外抑制性神经递质腺苷的水平。大量文献揭示腺苷水平是通过神经元和星形胶质细胞互动调节完成，且调节腺苷水平可直接影响兴奋性氨基酸的水平，但其发生的具体分子信号机制尚不清楚。近期研究显示环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）是ENT1 的下游因子。ENT1 是否通过CREB 信号通路参与脑缺血再灌注后兴奋性氨基酸毒性的形成尚无文献报道。本项目拟构建ENT1 慢病毒质粒对其进行功能研究，观察动物脑电行为以及膜片钳监测脑片电生理的变化，分子生物学技术检测神经细胞相关分子的表达；观察ENT1干预前后CREB的变化情况；最终比较不同组别脑组织中ENT1、pCREB及相关蛋白的表达，从分子信号机制的角度揭示脑缺血再灌注后兴奋性氨基酸毒性形成的机制，期望为其防治提供新靶点。

脑缺血再灌注后损伤与兴奋性氨基酸毒性密切相关。1 型平衡型核苷转运体(ENT1)可因微环境的变化而调节细胞内外抑制性神经递质腺苷A1的水平。腺苷水平是通过神经元和星形胶质细胞互动调节完成，且调节腺苷水平可直接影响兴奋性氨基酸的水平，但其发生的具体分子信号机制尚不清楚。近期研究显示环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)是ENT1 的下游因子。ENT1 是否通过CREB 信号通路参与脑缺血再灌注（IR）后兴奋性氨基酸毒性的形成尚无文献报道。本项目拟构建IR大鼠模型，检测神经细胞内ENT1等相关分子的表达;ENT1特异性抑制剂NBTI，对大鼠神经功能缺损程度和脑梗死体积的影响；观察ENT1干预前后CREB的变化情况;从分子信号机制的角度揭示脑缺血再灌注后兴奋性氨基酸毒性形成的机制，期望为其临床防治提供新诊疗靶点。免疫组织化和免疫荧光双重标记结果示：ENT1在大鼠海马CA3区的星形胶质细胞及神经元样细胞的胞膜上及胞浆内均有表达。使用ENT1抑制剂NBTI后显著减轻脑梗死体积比：由(45.41±14.65)% 下降为 (18.00±3.09)%），与对照组比具有显著差异（P＜0.01）。Western Blotting结果显示，与再灌注24小时组对比，抑制剂组中兴奋性氨基酸转运蛋白2（EAAT2）的表达明显增高，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。在 NBTI 预处理后 IR 24h组中腺苷 A1 受体表达量高于无NBTI组，可能机制是抑制 ENT1 后可以增加腺苷 A1 受体的表达。在IR 后24h使用ENT1（15 mg/kg）抑制剂干预，p-CREB的蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05)。本项目为兴奋性氨基酸毒性的脑保护新的临床药物开发提供了实验依据和新的药物作用靶点及治疗方案。